Муковисцидоз: определение, диагностические критерии, терапия. Национальный консенсус

Недавно описано несколько необычных проявлений инфекции, вызванной S. maltophilia. Так, в сообщении о 114 инфекциях из онкологического центра говорится, что у 17 больных наблюдали инфекции слизистой оболочки и кожных покровов и/или инфекции мягкой ткани, 6 имели метастатические целлюлиты, представлявшие собой кожные узлы с окружающими целлюлитами, и один – повреждение в виде гангренозной эктимы.

Каждый из рассматриваемых НФМО способен вызывать развитие хронической пневмонии у больных с МВ, исход которой, как правило, неблагоприятен для больного [10].

Микобактерии, не принадлежащие к виду Mycobacterium tuberculosis

В последние годы возросло количество случаев инфицирования больных МВ микобактериями, не относящимися к виду M. tuberculosis (Nontuberculous mycobacteria (NTM)). Из мокроты пациентов выделяли Mycobacterium avium-intracellulare (MAI), Mycobacterium chelonei, Mycobacterium fortuitum [19]. Среди пациентов с муковисцидозом в США бактерии NTM идентифицировали в 12,5% случаев, причем наиболее часто выделяли Mycobacterium avium complex (MAC). На втором месте по частоте высева были Mycobacterium abscessus [20]. Особенностью культивирования микобактерий является длительный период роста на питательной среде Левенштейна-Йенсена. Кроме того, у больных МВ образцы мокроты контаминированы P. aeruginosa и другими микроорганизмами. Рекомендуется обрабатывать образцы мокроты от больных МВ для устранения контаминации перед посевом 0,25% N-ацетил-L-цистеином и 1% гидроксидом натрия (NALC-NaOH), а затем добавлять 5% oxalic acid (OXA). Особое значение для идентификации и типирования этих микроорганизмов имеют молекулярно-генетические методы (ПЦР, мультилокусное секвенирование, секвенирование генома). Для точной постановки диагноза необходимы выделение культуры микобактерий и дальнейшее генетическое типирование [21].

Анаэробные микроорганизмы

Использование анаэробных культуральных методик указывает на обнаружение в дыхательных путях больных МВ большого числа анаэробов [14, 22]. В исследовании Tunney и cоавт. анаэробные бактерии, прежде всего Prevotella, Veillonella, Propionibacterium и Actinomyces, были изолированы в 64% образцов мокроты у пациентов с МВ. Колонизация P. aeruginosa достоверно повышает вероятность присутствия анаэробов в мокроте. Сходные анаэробные штаммы были обнаружены в бронхоальвеолярной жидкости у детей с МВ. В двух исследованиях показано, что микроорганизмы из рода Prevotella особенно часто встречаются у больных МВ [22]. Более того, высказывается предположение об их провоспалительном действии, что подтверждается резким увеличением концентрации данных микроорганизмов в период обострения. Тем не менее точно определить клиническое значение этих бактерий на сегодня не представляется возможным.

4.2. Алгоритм микробиологической диагностики хронической респираторной инфекции

Идентификация возбудителей хронической респираторной инфекции является важнейшим звеном в прогнозе для жизни больного МВ. В связи с этим в настоящее время в лабораторной диагностике используются современные микробиологические, молекулярно-генетические и молекулярно-биологические методы.

Правильная микробиологическая диагностика мокроты больных МВ затруднительна, так как микробная флора дыхательных путей у таких больных представлена часто ассоциациями, а некоторые микроорганизмы проявляют атипичные для своего вида фенотипические свойства, например ауксотрофные P. aeruginosa и SCV (small colony variants – фенотип мелких колоний) S. aureus. Разработанный алгоритм микробиологической диагностики хронической респираторной инфекции включает несколько этапов, позволяющих рационально и максимально достоверно провести диагностику смешанной хронической инфекции легких.

Материалом при исследовании НДП у больных МВ являются мокрота при кашле, мазок из зева после кашля, ларингеальный или назофарингеальный аспират, индуцированная гипертоническим раствором мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, материал щеточной биопсии при бронхоскопии. По данным Equi et al., чувствительность и специфичность результатов посевов мазка из зева после кашля по сравнению с результатами посевов спонтанной мокроты составляют 34 и 100% соответственно. Чувствительность показывает процент положительного результата, полученного методом посева мазка из зева, по сравнению с положительным результатом, полученным при посеве мокроты. Специфичность показывает процент отрицательного результата, полученного методом посева мазка из зева, по сравнению с отрицательным результатом, полученным при посеве мокроты [14]. Установлено, что любая задержка, в частности хранение при комнатной температуре (20-25 °C), приводит к увеличению количества быстро растущих бактерий, что может привести к угнетению роста истинных патогенов, и, наоборот, хранение в холодильнике (4 °C) может привести к гибели термофильных патогенных микроорганизмов.

Перед посевом мокроту предварительно отмывают в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида и гомогенизируют механическим (перемешивание в течение 10 мин стерильными микробиологическими бусами) или химическим (обработка дитиотреитолом) методом.

Обязательным для установления диагноза хронической инфекции, вызванной ассоциацией возбудителей, является неоднократное в течение 6 месяцев выделение чистой культуры микроорганизмов – так называемый «золотой стандарт». Поэтому посев мокроты осуществляют на универсальные среды – 5% кровяной и шоколадный агары с накладыванием на поверхность дисков с гентамицином и оптохином для выявления Haemophilus influenzaе и Streptococcus pneumoniaе и селективные среды для выделения S. aureus, P. aeruginosa, Bcc, Candida spp., Enterobacteriacеае и НФМО (ЖСА, цетримидный агар, BCSA, Сабуро, Эндо).

Идентификацию основных возбудителей хронической инфекции проводят следующим образом:

Идентификация золотистого стафилококка

Идентификацию стафилококков проводят на селективной среде – желточно-солевом агаре (ЖСА). На основании фенотипических свойств – наличия пигмента и лецитиназной активности штаммы стафилококков относят к виду S. аureus. Для подтверждения принадлежности стафилококка к виду S. аureus также необходимо использовать тест на коагулазу. Летициназоположительные стафилококки, характеризующиеся положительным тестом на коагулазу, относят к виду S. аureus.

У больных МВ встречаются атипичные формы золотистого стафилококка, которые трудно выделять и идентифицировать общепринятыми методами ввиду их замедленного роста и нетипичных для стафилококков свойств. Такие атипичные формы называют штаммами с фенотипом мелких колоний (small-colony variant (SCV)). Бактерии медленно растут, в результате через 48 ч роста формируются очень маленькие, без пигмента и гемолиза колонии, имеющие fried-egg-фенотип («яичницы-глазуньи») или точечный фенотип, редко – мукоидный фенотип. SCV-стафилококки имеют также другие атипичные, не свойственные метаболически нормальным стафилококкам свойства. Могут быть лецитиназоотрицательными, слабо коагулазоположительными, характеризоваться отсутствием фермента маннитола, ауксотрофными по гемину, тимидину и менадиону и характеризоваться возможностью возврата в родительскую форму. Часто ассоциируются с персистентной инфекцией и обладают резистентностью к антибиотикам [10].

По данным Gómez-González et al., распространенность SCV S. aureus в клинических экземплярах составляет приблизительно 1%, а среди больных МВ – до 17%. SCV S. aureus может часто высеваться от пациентов, которые получали гентамицин или другие аминогликозиды [11].

Лабораторная диагностика, определение чувствительности к антибиотикам атипичных форм золотистого стафилококка могут иметь существенное значение для выбора тактики антимикробной терапии стафилококковой инфекции у больных МВ.

В результате проведенных исследований было выявлено 12 штаммов SCV [14]. При этом в 6 случаях наблюдали смешанную инфекцию с P. aeruginosa. Четыре из выделенных штаммов были резистентными более чем к трем группам антибиотиков, у двух из которых выявлен ген MecA. Поэтому при выделении штаммов с SCV-фенотипом необходимо подтвердить принадлежность к виду S. aureus с использованием молекулярно-генетических методов (ПЦР, MLST) и исследовать их на антибиотикочувствительность.

При исследовании антибиотикочувствительности 208 штаммов стафилококков диско-диффузионным методом или с помощью ATB-стрипов (BioMerieux) было показано [14], что 31 (15%) штамм устойчив к оксациллину. 15 из этих штаммов были коагулазоположительными, что позволило, учитывая также пигментообразование и лецитиназную активность, отнести их к MRSA, а остальные 16 штаммов – к метициллин-резистентным коагулазоотрицательным стафилококкам (КОС).

Для определения устойчивости стафилококков к метициллину обычно используют диско-диффузионный метод [23]. Применяют диски с оксациллином (1 мкг), так как оксациллин является наиболее стабильным антибиотиком при хранении. Идентификацию осуществляют в условиях, способствующих экспрессии устойчивости, а именно на среде Мюллера-Хинтона с добавлением 4% NaCl, инкубируя чашки Петри в течение 24 ч при 37 °С. Некоторые исследователи предлагают проводить инкубацию в течение 48 ч при 30 °С [23].

В связи с имеющейся гетерогенностью устойчивости к метициллину ряд исследователей рекомендуют проведение идентификации гена mecA молекулярно-генетическими методами с использованием ДНК-зондов или амплификацией гена в ПЦР.

При выявлении у стафилококков устойчивости к метициллину диско-диффузионным методом и идентификации гена mecA генетическими методами такие штаммы рекомендуется далее тестировать на устойчивость к ванкомицину, так как большинство VISA и гетеро-VRSA обычно устойчивы к метициллину.

Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS) установил, что стафилококки, у которых рост ингибируется 4 и менее mg/ml ванкомицина, являются чувствительными, 8-16 mg/ml – умеренно устойчивыми и 32 и более mg/ml – резистентными. В соответствии с этими показателями в литературе умеренно устойчивые к ванкомицину штаммы S. aureus (MIC ванкомицина = 8 mg/ml) обозначают VISA, а резистентные (MIC = 32 и более mg/ml) – VRSA.

Большинство VISA-изолятов первоначально выглядят в виде смешанной популяции, состоящей из различных по морфологии и пигменту колоний. Преобладают большие, кремового цвета колонии и маленькие колонии серого цвета. Однако при тестировании различных по морфологии и цвету колоний на устойчивость к ванкомицину они демонстрируют идентичные профили антибиотикограмм и ДНК при тестировании с помощью пульс-электрофореза.

Так как способность формирования биопленок является свойством штаммов, способных вызывать хроническую инфекцию, оптимальным для полной характеристики штаммов является определение способности к формированию биопленок штаммами золотистого стафилококка. Было изучено формирование биопленок у 106 штаммов стафилококков, выделенных от больных МВ [14]. Из 106-ти изученных штаммов у 16 (16,9%) наблюдали выраженную способность к формированию биопленки, у 54 (57,2%) – умеренную, у 36 штаммов (38%) – низкую.

Таким образом, для точной идентификации видов стафилококков необходимо использовать комплекс бактериологических, биохимических, молекулярно-генетических методов.

Идентификация неферментирующих грамотрицательных микроорганизмов (НФМО)

Идентификация Pseudomonas aeruginosa

Род Pseudomonas (sensu stricto) включает 11 видов. Для больных МВ наиболее значимым является Pseudomonas aeruginosa.

Типичные изоляты синегнойной палочки идентифицируют по таким свойствам, как пигментообразование, положительный тест на оксидазу, рост при 42 °С, характерный земляничный запах, рост на цетримидном агаре. При этом от больных МВ с хронической синегнойной инфекцией часто изолируют атипичные формы P. aeruginosa, которые трудно идентифицировать без применения молекулярно-генетических методов (ПЦР) [24].

Псевдомонады хорошо растут на стандартных лабораторных средах, таких как триптиказный соевый агар с 5% бараньей кровью или шоколадный агар. Подобная среда может быть использована для выделения микроорганизмов из клинических проб, например цереброспинальной жидкости, тканевой жидкости или жидкости после перитонеального диализа, когда наиболее вероятным является выделение смешанной флоры. Для выделения P. aeruginosa из образцов, содержащих смешанную флору, используются селективные среды. Агар МакКонки – наиболее часто используемая селективная среда для выделения большинства псевдомонад, включая мукоидные штаммы P. aeruginosa от больных МВ. Селективные среды, содержащие селективные агенты, такие как цетримид, ацетамид, нитрофурантоин и 9-хлор-9-[4-(диэтиламино)-фенил]-9,10-дигидро-10-фенилакридин гидрохлорид (С390), также могут быть использованы для изоляции P. aeruginosa из клинических образцов и образцов окружающей среды [14, 22].

Большинство изолятов P. aeruginosa легко распознаются на первичной питательной среде на основе морфологических характеристик колоний, продукции диффундирующего пигмента, а также характерного запаха культуры «земляничного мыла», или, как его характеризуют зарубежные микробиологи, запаха «винограда или зерна тако». Колонии обычно имеют плоскую поверхность и склонность к ползучему росту, неровные края и металлический блеск, который часто связан с аутолизом. Существуют и другие виды колоний, включающие гладкие, колиформные колонии, а также слизистые, карликовые и мукоидные формы. Мукоидный вариант колоний преобладает в образцах из респираторного тракта больных МВ. P. aeruginosa продуцирует целый ряд водорастворимых пигментов. Когда пиовердин сочетается с голубым водорастворимым пигментом феназином, пиоцианин приобретает светло-зеленый цвет. Этот микроорганизм также может продуцировать один из двух водорастворимых пигментов: пиорубрин (красный) или пиомеланин (коричневый или черно-коричневый). Идентификация P. aeruginosa может быть подтверждена на основании положительного теста на оксидазу. Могут также встречаться беспигментные штаммы P. aeruginosa, очень часто это штаммы с повышенным содержанием мукоида, выделенные из секрета респираторного тракта больных МВ. На практике обнаружение мукоидных штаммов, представляющих собой грамотрицительные неферментирующие глюкозу палочки, выделенные из образцов респираторного тракта больных МВ, является достаточным для идентификации такого микроорганизма, как P. aeruginosa. Однако если выделяется беспигментный штамм, необходимо проследить основные биохимические характеристики, включая рост при 42 °С, гидролиз ацетамида, редукцию нитратов с образованием нитрогенного газа.

Значимым признаком для P. aeruginosa, как и для остальных представителей неферментирующих бактерий, является природная устойчивость ко многим антибиотикам, что, вероятно, обусловлено, с одной стороны, тем, что для многих микроорганизмов основной экологической нишей является почва (а среди почвенных микроорганизмов известно достаточное число штаммов-продуцентов антибиотиков), а с другой – многообразием у этих представителей различных внехромосомных элементов (плазмид, бактериофагов), способных нести в составе генома детерминанты лекарственной устойчивости.

Исследование чувствительности штаммов P. aeruginosa, выделенных от больных МВ в Российской Федерации, с помощью тест-системы АТВ и диско-диффузионным методом показало, что 100% штаммов P. aeruginosa были чувствительны к колистину, 85,5% – к цефтазидиму, 82% – к меропенему, 71% штаммов – к имипенему, азлоциллину, левофлоксацину и тобрамицину, 75% штаммов – к офлоксацину и ципрофлоксацину, 97% – к пиперациллину + тазобактаму, 92% – пиперациллину [14].

82% штаммов P. aeruginosa были устойчивы к ампициллину-сульбактаму, 79% – к ко-тримоксазолу, 79% – к цефотаксиму, 62,5% – к цефтриаксону и 83% – к левомицетину.

Однако при аэрозольном пути доставки антибиотиков лекарственное средство попадает непосредственно в просвет бронхов. При этом в бронхиальном секрете создаются высокие концентрации препарата при низком их уровне в сыворотке крови, что дает дополнительные возможности для преодоления часто наблюдаемой при МВ антибиотикорезистентности. Так, применение тобрамицина для ингаляций у больных МВ оправдано с точки зрения доказательной медицины и рекомендовано международными и отечественными руководствами по лечению инфекции легких, вызванной Pseudomonas aeruginosa.

Идентификация и дифференциация бактерий Burkholderia cepacia complex

Идентификация бактерий комплекса Bcc является многоэтапной и единственной в практике, где необходима комбинация фенотипических и генотипических методов, т.е. использование поли-фазного таксономического подхода. На 1-м этапе для выделения Bcc из образца осуществляют посев на селективную среду. Для выделения бактерий комплекса Bcc из мокроты больных МВ наиболее оптимальным является BCSA (Burkholderia cepacia complex selective agar) – агар, содержащий 1% лактозы, 1% сахарозы на обогащенной основе казеина и дрожжевого экстракта с добавлением 600 ЕД/мл полимиксина В, 10 мкг/мл гентамицина и 2,5 мкг/мл ванкомицина. На этой среде растут преимущественно бактерии комплекса Bcc, но наряду с ними могут расти B. gladioli, виды Ralstonia и S. maltophila. После выделения бактерий на селективной среде необходимо осуществить их идентификацию с помощью молекулярно-генетических методов. Могут использоваться и другие дополнительные тесты: определение гемолитической, протеазной активности, способности образования биопленки. На современном этапе для типирования используется метод мультилокусного секвенирования и секвенирования генома [3, 14, 17, 18].

Устойчивость к антимикробным препаратам

Из анализа антибиотикограмм штаммов Bcc [36], выделенных от 67 больных детей от 5 до 17 лет и от 38 взрослых больных, в процессе динамического наблюдения выявлено, что все штаммы являются мультирезистентными. Установлено, что абсолютно все штаммы резистентны к амикацину, гентамицину, тобрамицину и имипенему. К ко-тримоксазолу резистентны 88,6%, к хлорамфениколу – 58,7%, к цефепиму – 80,8%, к цефоперазону – 76,5%, к ципрофлоксацину – 85,5%, к цефтриаксону – 60,8%. Низкий процент резистентности был выявлен по отношению к меропенему и цефтазидиму – 14,1 и 17,9% соответственно, 71,8% штаммов были чувствительны к цефтазидиму, 56,4% – к меропенему, 90,9% штаммов Всс были чувствительны к комбинированному антибиотику пиперациллину-тазобактаму. При исследовании чувствительности к антимикробным препаратам также установлено, что все штаммы полирезистентны к 5 антибиотикам: имипенему, ко-тримоксазолу, тобрамицину, гентамицину и амикацину, что может свидетельствовать об их госпитальном происхождении. Таким образом, можно сделать заключение, что в процессе лечения штаммы приобретают устойчивость к антимикробным препаратам, что делает возможным длительную персистенцию микроорганизма и препятствует эрадикации возбудителя. Надо отметить, что данные антибиотикограмм, полученные в результате исследования in vitro, могут не отражать «истинной» чувствительности возбудителя в условиях in vivo. Тест определения антибиотикочувствительности может зависеть как от свойств самого возбудителя, в т.ч. и от способности образовывать биопленку, так и от условий его культивирования. Зарубежными авторами [37] было показано, что при исследовании 101 образца мокроты из каждого образца было выделено по 4 морфотипа колоний одного генотипа P. aeruginosa. Среди одного морфотипа практически каждая колония имела антибиотикограмму, отличную от других колоний одного морфотипа. 48 колоний P. aeruginosa, выделенных из одного образца мокроты, имели различные антибиотикограммы. Однако приведенные выше данные не отрицают, а подтверждают необходимость постоянного мониторинга антибиотикочувствительности штаммов микроорганизмов у больных МВ.

Точная идентификация НФМО от больных МВ является наиболее сложной задачей. Очень часто нетипичные по фенотипическим свойствам микроорганизмы ошибочно могут диагностироваться как другие виды микроорганизмов. Ложная идентификация P. aeruginosa или Bcc может иметь нежелательные последствия, ведущие к выбору неправильной терапии и изоляции пациентов.

Например, в проведенном исследовании [14] два штамма атипичной P. aeruginosa и два штамма A. xylosoxidans были неправильно идентифицированы API 20NE как Всс, 12 штаммов Bcc биохимическими тестами (LaChema) были неправильно идентифицированы как другие НФМО. Около 3,4% штаммов биохимическими тестами не удалось идентифицировать вообще. Для окончательной точной идентификации были использованы молекулярно-генетические методы. Kiska et al. показали в своей работе, что точность идентификации НФМО четырьмя различными коммерческими тест-системами составляет 57-80%, а точность идентификации Всс – 43-86%. При этом все тесты идентифицировали НФМО, не являющиеся Всс, как Всс [25].

В связи с этим методы, основанные на ПЦР, в частности ПЦР-real-time, могут быть незаменимыми в сложных ситуациях.

Для точной идентификации Всс необходимо соблюдать следующую схему:

• посев мокроты на 5% кровяной агар, BCSA с дальнейшим выделением чистой культуры;

• исследование чистой культуры молекулярно-генетическими методами: ПЦР на recA-ген [16];

• исследование мокроты молекулярно-генетическими методами [26];

• в настоящее время могут использоваться MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorbtion-Ionization Time of Flihgt), масс-спектрометрия.

Идентификация Achromobacter spp.

Очень часто A. хylosoxidans, A. ruhlandii ложно диагностируют как Всс в связи с фенотипическим сходством с Bcc при культивировании на 5% кровяном агаре и ростом на BCSA – селективной для Всс среде. Для подтверждения принадлежности бактерии к виду A. хylosoxidans необходимо использовать тест-системы API 20 NE (BioMerieux) и ПЦР для выявления локуса в 16S рДНК со специфическими праймерами AX-F1 и AX-B1 [14, 27].

Идентификация анаэробной инфекции

В результате процессов в легких при МВ, приводящих к нарушению мукоцилиарного очищения, нарушается газообмен в легких и могут создаваться анаэробные условия, что способствует возникновению анаэробной инфекции. Исследования показали [14], что причиной легочной инфекции могут быть также анаэробные микроорганизмы. У 2 детей классические бактериологические методы не позволили идентифицировать возбудителя легочной инфекции. При исследовании мокроты с помощью ПЦР-real-time были выявлены анаэробные микроорганизмы. Для выращивания и идентификации анаэробов необходимы специальные анаэробные условия (анаэростат). При отсутствии анаэростата методом выбора является ПЦР-real-time, используя которую идентификация анаэробов возможна непосредственно в мокроте.

4.3. Эпидемиология хронической респираторной инфекции у больных муковисцидозом

Источник инфекции

Около 40% здоровых людей являются носителями S. aureus на передней поверхности носовых ходов и на коже. В связи с этим важным источником хронической инфекции, вызванной золотистым стафилококком, могут быть здоровые лица, включая медперсонал, членов семей больных МВ, и лица, с которыми общается больной МВ. Источником инфекции может быть также воздух медицинских палат, жилых комнат, в которых может циркулировать S. aureus. Особую опасность представляют метициллин-устойчивые штаммы золотистого стафилококка (MRSA), которые свидетельствуют, с одной стороны, о приобретении больными таких штаммов, вероятнее всего, в больнице, а с другой – о проблеме выбора антимикробных препаратов для лечения хронической инфекции, так как MRSA, как правило, устойчивы ко многим антибиотикам [28]. Сообщается о возможности передачи MRSA пациентам с МВ от лиц без МВ (например, медперсонала, родственников) или других пациентов с МВ. По данным российских исследователей [14], среди штаммов S. aureus, выделенных из мокроты больных с МВ, доля MRSA составляет около 20%. Предварительные результаты молеклярно-генетического типирования свидетельствуют о том, что определенная часть штаммов MRSA являются внутрибольничными штаммами, тогда как другие, вероятно, имеют внегоспитальное происхождение. Инфицирование внутрибольничными штаммами свидетельствует о том, что госпитализация, хирургические вмешательства, использование катетеров могут быть факторами риска развития хронической респираторной инфекции у больных МВ.