БИОХИМИЯ (практикум)

Денатурация

белков

концентрированными

минеральными

кислотами

Концентрированные минеральные кислоты (Н2 SO4, НСl, НNO3 и др.) вызывают необратимое денатурационное изменение белков, следствием чего является агрегация белковых молекул и их осаждение.

Денатурирующее действие минеральных кислот может быть объясне-но их воздействием на функциональные группы белка. Минеральные кис-лоты, например, превращают отрицательную группу –СОО– в недиссоции-рованную группу –СООН, что приводит к нарушению ионных связей (со-левых мостиков) и, как следствие, к разворачиванию полипептидных цепей. Длительное воздействие на белок концентрированных минеральных кислот может вызвать гидролиз белка (разрыв пептидных связей), а также

реакции нитрования окисления, сульфирования, конденсации и др.

Ход

работы

К 1 мл концентрированной соляной кислоты осторожно, под тя-гой, по стенке пробирки добавляют 1 мл раствора яичного альбумина так, чтобы не смешивать жидкости.

На границе соприкосновения двух жидкостей образуется белое кольцо выпавшего в осадок белка. При осторожном смешивании жид-костей осадок не исчезает.

В двух других пробирках проводят такие же опыты, но с концен-трированными соляной и азотной кислотами. Результаты наблюдений вносят в табл. 5.

Г.

Денатурация

белков

органическими

кислотами

Белки из растворов необратимо осаждают органическими кислота-ми. Трихлоруксусная кислота — CCI3 COOH (ТХУ) и сульфосалицило-

вая кислота С6 Н3 (ОН) (СООН)SО3 Н являются очень чувствительными специфическими реактивами на белок и широко применяются как дена-турирующие соединения.

Денатурация белков органическими кислотами основана на их спо-собности нейтрализовать заряд молекулы белка и разрушать ее про-странственную структуру.

Осаждение белков трихлоруксусной кислотой часто применяют для полного удаления белков из биологических жидкостей (например, из сыворотки крови).

Ход

работы

В пробирку вносят 1 мл раствора белка и добавляют несколько ка-пель 10%-й трихлоруксусной кислоты. Выпадает осадок белка.

Результаты наблюдений вносят в табл. 5.

Д.

Денатурация

белков

солями

тяжелых

металлов

При действии небольших концентраций солей тяжелых метал-лов (Сu+2, Рв+2, Аg+2, Аs+3, Нg+2, Вi+3) на растворы белка происходит де-натурация белковых молекул. Осаждение денатурированного белка об-условлено адсорбцией иона тяжелого металла на поверхности белковой молекулы и образованием нерастворимых в воде комплексных соедине-ний. Кроме того, тяжелые металлы снимают электрический заряд и глу-боко изменяют вторичную и третичную структуры макромолекул белка, образуют связи между функциональными группами молекул.

Ход

работы

К 2 мл раствора яичного альбумина добавляют 5 капель 1%-го раствора сульфата меди. Выпадает осадок, который растворяется в из-бытке (7–10 мл) раствора этой соли.

К 2 мл раствора яичного альбумина добавляют 5 капель 0,5%-го раствора ацетата свинца. Выпадает осадок, который растворяется так-же при избытке раствора этой соли. Результаты наблюдений заносят в табл. 5.

Е.

Денатурация

белков

специфическими

реактивами

Необратимое осаждение белков можно вызвать воздействием на их растворы различными специфическими реактивами: танином (сложным эфиром глюкозы и пяти молекул метадигалловой кислоты), пикриновой кислотой, гексацианоферратом (II) калия К4 [Fе (СN)6] и др.

Механизм осаждения белков этими реактивами заключается в обра-зовании нерастворимых комплексных соединений с азотистыми группа-ми белков.

Ход

работы

Осаждение белков танином.

В пробирку вносят 1 мл раствора яичного альбумина, добавля-ют несколько капель 1%-й уксусной кислоты и 1 мл насыщенного рас-твора танина. Выпадает осадок желтовато-серого цвета.

Осаждение белков пикриновой кислотой.

К 1 мл раствора яичного альбумина, подкисленного уксусной кис-лотой, добавляют несколько капель насыщенного раствора пикриновой кислоты. Образуется желтоватый осадок белка.

Осаждение белков гексацианоферратом (II) калия.

К 1 мл раствора яичного альбумина, подкисленного уксусной кис-лотой, по каплям добавляют 5%-й раствор гексацианоферрата (II) калия. Выпадает осадок белка.

Результаты наблюдений вносят в табл. 5. Таблица 5

№ опыта

Исследуемый материал

Денатурирующий фактор и условия его

воздействия

Результаты опыта

Контрольные

вопросы

Что такое денатурация белков?

Какие денатурирующие факторы вы знаете и в чем особенности их действия?

Какие структуры белковых молекул изменяются при денатура-ции?

Является ли денатурация обратимым процессом?

Как изменяются физико-химические и биологические свойства белков при их денатурации?

Реактивы

и

оборудование

1. Раствор яичного альбумина (к п. А), (приготовление см. ра-боту 6). 2. 96%-й этиловый спирт. 3. 80%-й ацетон. 4. Раствор яич-ного альбумина (пункты: Б, В, Г, Д, Е): белок куриного яйца отделя-ют от желтка, смешивают с 19–20-кратным объемом воды и филь-труют через несколько слоев марли.5. 1%-я уксусная кислота.

Концентрированная серная кислота. 7. Концентрированная соляная кислота. 8. Концентрированная азотная кислота. 9. 1%-й сульфат меди.

0,5%-й уксуснокислый свинец. 11. Насыщенный раствор танина.

12. Насыщенный раствор пикриновой кислоты. 13. 5%-й гексациано-феррат (II) калия К4 [Fе (СN)6]. 14. 10%-я тpиxлopукcуcнaя кислота.

15. 20%-я сульфосалициловая кислота. 16. Пробирки. 17. Пипетки.

18. Водяная баня.

Работ

а

8.

РАЗДЕЛЕНИЕ

И

ОЧИСТКА

БЕЛКОВ

МЕТОДОМ ДИАЛИЗА

Процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных со-единений с помощью полупроницаемых мембран называется диализом.

Метод диализа основан на неспособности коллоидных частиц проникать через полу-проницаемые перегородки (искусственные и естественные мембраны) из-за больших размеров этих частиц. При этом низкомо-лекулярные частицы (органические и неор-ганические) легко проходят через поры по-

фужной пробирке, содержащий глобулины, также оставляют для иссле-дований (см. п. 6).

5. Альбуминовую природу белков центрифугата подтверждают соответствующими реакциями их осаждения и растворения:

а) в одну пробирку вносят 1 мл центрифугата и добавляют 2 мл воды.

Отмечают отсутствие осадка;

б) во вторую пробирку вносят 1 мл центрифугата и добавляют 2 мл насыщенного раствора сульфата аммония до полного насыщения. Отмечают выпадение альбуминов в осадок.

6. Глобулиновую природу белков осадка, полученного после цен-трифугирования (см. п. 4), также доказывают с помощью реакций рас-

Рис. 3. Схема диализатора:

1

—

диализуемая

жидкость;

2

—

мембрана;

3

—

мешалка

лупроницаемых мембран (рис. 3).

Простейшим диализатором может слу-жить целлофановый мешочек, опущенный в стакан с водой. Раствор белка помещают

творения и осаждения этих белков:

а) к осадку глобулинов в центрифужной пробирке добавляют 5 мл 10%-го раствора хлорида аммония, помешивая содержимое пробирки стеклянной палочкой. Отмечают растворение осадка в солевом растворе;

в мешочек, при этом молекулы низкомолекулярных веществ легко диф-фундируют через стенку мешочка, а крупные молекулы белка остаются внутри мешочка.

Ход

работы

10–15 мл раствора альбуминов, глобулинов и сульфата аммония, помещают в целлофановый мешочек, завязывают его и погружают в двух-литровый стакан с проточной водой. Мешочек закрепляю в стакане специ-альными зажимами таким образом, чтобы верхний край мешочка высту-пал над поверхностью воды. Диализ проводят в течение 3–4-х часов.

После окончания диализа анализируют воду из стакана на при-сутствие белков и солей:

а) к 1 мл воды из стакана добавляют 2 мл 10%-го раствора гидрок-сида натрия и 1 мл 1%-го раствора сульфата меди (биуретовая реакция). По отсутствию фиолетовой окраски убеждаются, что белков в ста-кане с водой нет;

б) к 1 мл воды из стакана добавляют 5–10 капель 5%-го раствора хлорида бария. Выпадает осадок сульфата бария, показывающий, что ионы SO –2 свободно проходят из мешочка в воду.

4

Через 3–4 часа от начала диализа отмечают появление осадка внутри мешочка. Осадок представляет собой смесь белков глобулинов.

Содержимое мешочка перемешивают и сливают в колбу на 100 мл. В центрифужную пробирку отбирают из этой колбы 15 мл раствора и центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин.

Центрифугат, содержащий альбумины, сливают в чистую пробирку и оставляют для дальнейших исследований (см. п. 5). Осадок в центри-

б) в две пробирки отбирают по 1 мл солевого раствора глобулинов, полученного в центрифужной пробирке.

В одну пробирку добавляют 7 мл дистиллированной воды, в дру-гую —1 мл насыщенного раствора сульфата аммония до полунасыщения и оставляют на 1 час. В обеих пробирках выпадает осадок глобулинов.

Результаты опытов оформляют в виде табл. 6 и зарисовывают диа-лизатор в рабочем состоянии.

Таблица 6

№ пробы

Объект исследования

Исследуемые соединения (белки

или низкомо-лекулярные

вещества)

Используемые цветные реакции, методы растворения

или высаливания

Результаты опытов

Контрольные

вопросы

В чем состоит принцип процесса диализа?

Как устроен простейший диализатор?

Почему методом диализа можно отделить солерастворимые бел-ки от водорастворимых?

Какие свойства альбуминов и глобулинов используют для опреде-ления природы белка в осадке и надосадочной жидкости?

Реактивы

и

оборудование

1. Раствор яичного белка: белки трех куриных яиц отделяют от жел-тков, смешивают с 700 мл дистиллированной воды и 30 мл насыщенного раствора сульфата аммония и отфильтровывают через несколько слоев марли. 2. 10%-й раствор гидроксида натрия. 3. 1%-й раствор сульфата меди. 4. 5%-й раствор хлорида бария. 5. Насыщенный раствор сульфа-

та аммония (79 г (NH4)2 SO4 растворяют в 100 мл Н2 О). 6. 10%-й рас-твор хлорида аммония. 7. Химический стакан на 2 л. 8. Коллодиевый или целлофановый мешочек. 9. Зажимы для мешочка. 10. Пробирки.

Колба на 100 мл. 12. Центрифуга на 3000 об/мин.

Работа 9. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ

КРОВИ

МЕТОДОМ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Электрофоретический метод разделения белковых смесей основан на различии скоростей перемещения белковых молекул в электрическом поле в зависимости от их размеров и величины электрического заряда. Величина и знак заряда белковых молекул зависят от соотношения ос-новных и кислотных групп на их поверхности и рН среды. Так, напри-мер, все фракции белков сыворотки крови при рН 8,6 заряжены отрица-тельно, поэтому перемещаются в электрическом поле к аноду.

Существует несколько разновидностей электрофоретического ме-тода фракционирования белков: электрофорез в жидкой среде; в ге-лях (крахмальном, агаровом, полиакриламидном); на бумаге.

Электрофорез белков сыворотки крови на бумаге осуществляется в специальной электрофоретической камере, подключенной к источни-ку электрического тока. Проявление белковых фракций на носителе про-изводится обработкой электрофореграмм специальными красителями, окрашивающими белки. Вычисление соотношения количеств отдель-ных фракций белков производится с помощью денситометра и плани-метра либо путем последовательного вымывания окрашенных фракций с электрофореграмм с последующим фотоэлектроколориметрировани-ем окрашенных растворов.

Ход

работы

Подготовка и проведение электрофореза.

Электрофоретическое разделение проводят на приборе ПЭФ-1. Он состоит из камеры с крышкой, двух кювет, двух электродов (рис. 4). Электроды при работе помещают в кюветы и с помощью проводов и ште-керов подключают к блоку питания. Так как электрофоретический аппарат работает под напряжением 200–400 В, он должен быть надежно заземлен.

Рис. 4. Аппарат для низковольтного электрофореза на бумаге: 1 — крышка; 2 — носитель (бумага); 3 — фитиль-мостик;

4 — буферная камера; 5 — изолирующая пластина

Для проведения электрофореза вырезают полоску быстро впи-тывающей хроматографической бумаги длиной 33 см и шириной

5 см. Поперек полоски, на расстоянии 8–10 см от ее узкого края прово-дят простым карандашом тонкую линию старта. На отмеченную каран-дашом линию наносят микропипеткой или с помощью покровного стек-ла исследуемую сыворотку крови в количестве 0,01–0,03 мг. Полоску смачивают буфером и просушивают между листами фильтровальной бу-маги. Затем подсушенную полоску помещают в электрофоретическую камеру так, чтобы её концы были погружены в кюветы, заполненные буфером. В зависимости от конструкции в камеру можно помещать од-новременно 7–10 полосок.