Полная версия:
БИОХИМИЯ (практикум)
Для
оценки
степени
распределения
аминокислот
на
хроматограмме введен фактор разделения R
f
:
где a — расстояние между линией старта и центром пятна амино-кислоты на хроматограмме, мм;
b — расстояние между линией старта и фронтом растворителя, мм.
Чем больше растворимость аминокислот, например, в органическом растворителе, тем быстрее они движутся вслед за фронтом растворите-ля и тем больше у них величина.
На величину Rf влияет природа адсорбента и растворителя (элюента), хи-мическое строение аминокислот, температура и другие факторы. Величина Rf является характерной для каждой аминокислоты при данных условиях опыта.
Качественное определение аминокислот основано на проявлении хро-матограммы нингидрином и сравнении Rf анализируемых аминокислот с Rf известных (стандартных) аминокислот, называемых «свидетелями».
Для количественного определения аминокислот хроматографиче-ские пятна элюируют из слоя сорбента полярным растворителем, изме-ряют оптическую плотность окрашенных растворов и по калибровочно-му графику находят содержание аминокислот в исследуемом гидролиза-те или смеси аминокислот (см. работу 12).
Устройство
для
тонкослойной
хроматографии
представлено
на рис. 1.
Рис.
1.
Устройство
для
тонкослойной
хроматографии
Ход
работы
Нанесение аминокислот на хроматографическую пластину.
Для тонкослойного хроматографирования берут силуфоловую пла-стинку, представляющую собой алюминиевую фольгу, на которую нане-сен тонкий слой высокопористого активированного силикагеля.
Поперек пластинки, на расстоянии 1–1,5 см от ее узкого края прово-дят карандашом тонкую сплошную линию старта, стараясь не повредить слой силикагеля. На линии старта карандашом отмечают точки нанесе-ния растворов аминокислот на расстоянии около 1 см одна от другой.
В первую точку наносят стеклянным капилляром 1–2 мкл спиртово-го раствора, содержащего смесь аминокислот с концентрацией каждой аминокислоты, равной 0,01 М. В остальные точки разными капилляра-ми наносят последовательно по 1–2 мкл стандартных спиртовых раство-ров известных аминокислот («свидетелей»). Пластинку подсушивают на воздухе до полного испарения растворителя.
Хроматографическое разделение аминокислот.
Край пластинки, на который нанесены растворы аминокислот, опуска-ют в растворитель (смесь бутанола, уксусной кислоты и воды), налитый на дно хроматографической камеры так, чтобы линия старта была выше уровня растворителя. Пластинку устанавливают в камере в наклонном по-ложении, затем герметически закрывают камеру пришлифованной крыш-кой. Растворитель в течение 20–40 мин обычно поднимается до верхнего края пластинки, увлекая за собой растворенные в нем аминокислоты.
Разделение можно считать законченным, когда растворитель прой-дет 2/3 длины пластинки. Пластинку вынимают из камеры и подсушива-ют на воздухе (под тягой) 5–10 мин до исчезновения паров растворителя.
Проявление хроматограммы.
Аминокислоты на хроматограмме проявляют, используя нинги-дриновую реакцию (см. работу 1, п.А). Для этого пластинку или опры-скивают 0,1%-ным раствором нингидрина в ацетоне из пульверизатора и помещают в сушильный шкаф с температурой 105 ○C на 5 мин, или порошок нингидрина насыпают в хроматографическую камеру в смесь растворителей перед началом хроматографического разделения. После окончания разделения пластинку вынимают, cлегка подсушивают на воз-духе и помещают в сушильный шкаф с температурой 105 ○C на 5 мин.
Аминокислоты анализируемой смеси и «свидетели» проявляют-ся в виде сине-фиолетовых пятен. Некоторые аминокислоты (пролин, оксипролин) при взаимодействии с нингидрином дают желтые пятна. Интенсивность окраски пятен зависит от концентрации аминокислот.
Качественное определение аминокислот.
Полученную хроматограмму зарисовывают, указывая на ней прояв-ленные аминокислоты.
Сравнивают расстояние, пройденное каждой исследуемой амино-кислотой смеси, с расстоянием, пройденным каждым «свидетелем».
Определяют Rf каждой исследуемой аминокислоты и «свидетеля» по формуле (1). Для этого с точностью до миллиметра линейкой изме-ряют расстояние, пройденное каждой аминокислотой и растворителем
от линии старта до центра пятна.
Сопоставляют Rf величины аминокислот исследуемой смеси и ами-нокислот-«свидетелей» и делают заключение о природе аминокислот в составе изучаемой смеси.
Контрольные
вопросы
В чем состоит принцип тонкослойной хроматографии?
Какие факторы определяют степень перемещения аминокислот по хроматограмме?
Какая цветная реакция на аминокислоты используется при прояв-лении хроматограммы?
Что такое Rf и его назначение?
Реактивы
и
оборудование
1. Смесь аминокислот с концентрацией каждой аминокислоты в смеси, равной 0,01 М. 2. 0,01 М стандартные растворы аминокислот (“свидетелей”) в 10%-ном растворе пропилового спирта. Навески аминокислот для приго-товления 10 мл 0,01 М раствора, мг: фенилаланин — 15,1, валин — 11,7, треонин — 11,9, пролин — 19,0, лизин солянокислый — 18,1, гистидин — 22,7, аланин — 6,8, аспарагиновая кислота — 13,3, аргинин солянокис-лый — 21,0, метионин — 14,9, серин — 10,5, глицин — 7,5, изолейцин или лейцин — 13,1, триптофан — 20,4, цистин — 23,8, 3. 0,1%-й раствор нинги-дрина в ацетоне. 4. Растворитель (элюент): бутанол, уксусная кислота и вода в соотношении 6:2:2. 5. Силуфоловая пластинка. 6. Карандаш. 7. Линейка.
8. Капилляры на 0,1 мл. 9. Электроплиткa. 10. Хроматографическая камера.
11. Пульверизатор. 12. Сушильный шкаф на 100–105 ○С.
Работа
4. РАСТВОРИМОСТЬ
БЕЛКОВ
Белки различаются по своей растворимости в водных системах. Это различие используют для разделения белковых смесей.
Многие глобулярные белки хорошо растворяются в воде, что обу-словлено наличием на поверхности белковой молекулы свободных ги-дрофильных групп (-ОН, — NH2-СООН и др.).
Растворимость белка в воде зависит от характера белка, реакции среды и присутствия электролитов. В кислой среде лучше растворяются
белки, обладающие кислыми свойствами (альбумины, глобулины, про-ламины, глютелины). Щелочные белки (протамины и гистоны) лучше растворяются в щелочной среде.
Различие в растворимости отмечается как среди кислотораствори-мых, так и среди щелочерастворимых белков. Например, альбумины растворяются в дистиллированной воде, а глобулины растворяются в воде только в присутствии электролитов.
Однако есть фибриллярные белки, например белки соединительной ткани: коллаген, эластин, кератин и другие, — которые не растворяются в воде, солевых растворах, кислотах и щелочах, так как они отличаются
Исследуемый белок
Растворимость белков
в дистилли-
рованной воде
в 5%-мрастворе
хлорида натрия
в 0,2%-м растворе
гидроксида натрия
Таблица 2
Контрольные
вопросы
весьма высоким (до 90%) содержанием аминокислот с гидрофобными группами (CH3-CH2-CH2-и др.). Например, в белке коллагене высоко со-держание лизина, пролина и оксипролина.
Ход
работы
В одну пробирку вносят 2 капли неразведенного яичного белка и 20 капель дистиллированной воды, содержимое перемешивают и остав-ляют на 3–5 мин. При этом альбумин растворяется, а яичный глобулин выпадает в виде небольшого осадка. Раствор фильтруют через бумажный складчатый фильтр, предварительно смоченный водой. В фильтрате обна-руживают белок с помощью биуретовой реакции (см. работу 1, п.А).
В другую пробирку вносят 2 капли яичного белка и 20 капель 5%-го раствора хлорида натрия. В слабосолевом растворе растворяются и альбумины, и глобулины. Белковую природу раствора также определя-ют биуретовой реакцией.
200 мг пшеничной или соевой муки растирают в фарфоровой ступке с 5 мл 0,2%-го раствора гидроксида натрия. В раствор перехо-дят альбумины, глобулины и глютелины. Содержимое ступки переносят в пробирку, и после отстаивания верхний мутноватый слой исследуют на содержание белков при помощи биуретовой реакции.
В 3 пробирки помещают небольшое количество измельченной кости, содержащей белок коллаген. В одну из этих пробирок вносят 20 капель воды, в другую — 20 капель 5%-гo раствора хлорида на-трия, в третью — 5 мл 2%-го раствора гидроксида натрия. Коллаген не растворяется в воде, солевом растворе и растворе щелочи.
Результаты работы записывают в табл. 2, в которой отмечают растворимость различных белков, и делают выводы.
Как влияет аминокислотный состав белков на их растворимость?
В чем растворяются альбумины, глобулины, глютелины?
Назовите белки, не растворимые в воде, солевых растворах, щелочах.
Реактивы
и
оборудование
Белок яичный неразведенный. 2. Пшеничная или соевая мука.
Кость измельченная. 4. 5%-й раствор хлорида натрия. 5. 0,2%-й рас-твор гидроксида натрия. 6. Реактивы для проведения биуретовой реак-ции (см. работу 1). 7. Пробирки. 8. Пипетки на 1 мл. 9. Стеклянные па-
лочки. 10. Воронки. 11. Фильтры.
Работа
5.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ
ТОЧКИ
КАЗЕИНА
Белки, благодаря присутствию в их составе амино- и карбоксиль-ных групп, существуют в растворах в виде двухзарядных частиц.
В зависимости от количества в белке амино- или карбоксильных групп его молекула в водном растворе приобретает тот или иной заряд. Большинство белков животного происхождения содержит в своем составе больше дикарбоновых аминокислот, чем диаминокислот, поэтому они за-ряжаются отрицательно (белки-анионы), некоторые белки имеют в своем составе избыток диаминокислот и заряжены положительно (белки-катио-ны). Одноименный заряд белковых молекул способствует взаимному от-талкиванию частиц, что обеспечивает устойчивость их в растворе.
Число
ионизированных
групп
в
белке
может
быть
увеличено
или
умень-
шено при изменении рН среды. В кислой среде (рН < 7) подавляется диссо-
циация
карбоксильных
групп
и
суммарный
отрицательный
заряд
белковой
молекулы уменьшается. В щелочной среде (рН > 7) подавляется ионизация
аминогрупп
и
уменьшается
суммарный
положительный
заряд
белка:
При определенном значении рН число положительных зарядов бел-ковой молекулы будет равным числу отрицательных зарядов, и суммар-ный заряд белка станет равным нулю. Состояние белка, при котором суммарный заряд его равен нулю, называется изоэлектрическим состо-янием. рН, при котором белок находится в изоэлектрическом состоя-нии, называется изоэлектрической точкой и обозначается рI. В изоэ-лектрическом состоянии за счет равенства зарядов силы кулоновского отталкивания белковых частиц ослабляются, что способствует агрега-ции белковых молекул и выпадению белка в осадок.
Изоэлектрическая точка белков-анионов обычно проявляется при рН < 7, а белков-катионов при рН > 7. Зная значение изоэлектрической точки белков, можно использовать изоэлектрическое осаждение для вы-деления и фракционирования белков.
При дальнейшем добавлении щелочи или кислоты к белку, выпав-шему в осадок в изоэлектрическом состоянии, наступает перезарядка его молекул и белок вновь растворяется. Таким образом, изоэлектриче-ское осаждение белков — процесс обратимый.
Определение изоэлектрической точки белка молока казеина основано на том, что в изоэлектрическом состоянии казеин теряет растворимость и легко осаждается, что проявляется в выраженном помутнении раствора.
Ход
работы
В восьми пробирках готовят буферные смеси с разными значени-ями рН (табл. 3).
Таблица 3
№ пробирки
Кол-во 0,01 н CH3 COOH, мл
Кол-во 0, 1 н CH3 COOH,мл
Кол-во воды,мл
рH смеси
1
0,60
-
8,40
5,9
2
1,25
-
7,75
5,6
3
-
0,25
8,75
5,3
4
-
0,50
8,50
5,0
5
-
1,00
8,00
4,7
6
-
2,00
7,60
4,4
7
-
4,00
5,00
4,1
8
-
8,00
1,00
3,8
Содержимое пробирок перемешивают и в каждую вносят по 1 мл раствора казеина.
После перемешивания отмечают пробирку с наибольшей степе-нью помутнения и находят по табл. 3 рН раствора в этой пробирке. Это значение рН и является изоэлектрической точкой казеина.
Контрольные
вопросы
Что такое изоэлектрическая точка белков?
Является ли изоэлектрическое осаждение обратимым?
В чем заключается практическое применение изоэлектрического осаждения белков?
Реактивы
и
оборудование
1. Раствор казеина: к 0,2 г казеина добавляют 5 мл 1 н раствора уксуснокислого натрия и осторожно нагревают. Казеин растворяет-ся. В раствор добавляют воду до объема 50 мл. 2. 0,1 н уксусная кис-лота. 3. 0,01 н уксусная кислота. 4. Пипетки на 1 и 5 мл. 5. Пробирки
на 10–15 мл. 6. Бюретки градуированные.
Работа 6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИНИМАЛЬНОЙ
КОНЦЕНТРАЦИИ
СОЛИ
ДЛЯ
ВЫСАЛИВАНИЯ АЛЬБУМИНОВ
Выпадение белков в осадок при добавлении к их растворам ней-тральных солей в высоких концентрациях называется высаливанием. К нейтральным солям относятся соли щелочных и щелочноземельных металлов: NaCI, KCI, Na2 SO4, (NН4)2 S04, MgSO4.
Высаливание основано на снижении степени гидратации белковых
частиц
вследствие
связывания
молекул
воды
с
ионами
соли.
Лишенные части
гидратной
оболочки
белковые
частицы
агрегируют,
слипаются и выпадают в осадок (рис. 2).
Гитратная
о6олочка
Белок в растворе Высаливание белка Осадок белка
Рис. 2. Схема высаливания белка хлоридом натрия
Выпадение белков в осадок при высаливании — обратимый про-цесс, т. е. осадок белка можно вновь растворить. Легче высаливаются те белки, которые труднее растворяются в воде. Например, солераство-римые белки глобулины высаливаются легче, чем альбумины, так как часть оболочки у них солевая. Варьируя концентрацию нейтральных со-лей, можно выделить из раствора различные белковые фракции.
В работе необходимо определить минимальную концентрацию сульфата аммония для высаливания альбумина. Ее определяют как наи-меньшую концентрация соли в растворе, при которой белок начинает выпадать в осадок.
Ход
работы
Берут 9 пробирок, в каждую из них вносят из бюретки воду, за-тем пипеткой — насыщенный раствор сульфата аммония в количествах, указанных в табл. 4. В пробирку № 9 после внесения всех реактивов добавляют на кончике шпателя кристаллический сульфат аммония.
Содержимое каждой пробирки хорошо перемешивают. В каждой пробирке устанавливается определенная концентрация насыщения рас-твора солью (см. последнюю графу табл. 4).
Таблица 4
№ пробирки
Кол-во воды, мл
Кол-во насыщенного (NН4)2 SО4, мл
Концентрация
(NН4)2 SО4
от полного
насыщения,%
1
7,0
2,0
20
2
6,0
3,0
30
3
5,0
4,0
40
4
4,0
5,0
50
5
3,0
6,0
60
6
2,0
7,0
70
7
1,0
8,0
80
8
0,0
9,0
90
9
0,0
9,0 + крист. соль
100
После перемешивания во все пробирки добавляют по 1 мл рас-твора яичного альбумина.
Отмечают пробирку с минимальной концентрацией сульфата аммо-ния, в которой начинается помутнение. Эта концентрация соответствует началу высаливания белка. По последней графе табл. 4 определяют кон-
центрацию сульфата аммония в% от полного насыщения, соответствую-щую номеру пробирки, где началось высаливание.
Примечание: максимальная концентрация сульфата аммония для альбуминов составляет 100% от насыщения, а для глобулинов — 50% от насыщения.
Контрольные
вопросы
Что такое высаливание белков?
Какие соли используются для высаливания?
В чем заключается механизм высаливания белков?
Является ли высаливание обратимым осаждением белков?
Какие белки легче высаливаются — альбумины или глобулины?
Укажите максимальную концентрацию сульфата аммония для вы-саливания альбуминов.
Для чего применяется высаливание в практике?
Растворы
и
оборудование
1. Раствор яичного альбумина: белок куриного яйца отделя-ют от желтка, смешивают с пятикратным объемом воды и отфиль-тровывают выпавший в осадок глобулин. Полученный фильтрат содержит яичный альбумин. 2. Насыщенный раствор сульфата ам-мония. 3. Кристаллический, тонко измельченный сульфат аммо-ния. 4. Пробирки. 5. Пипетки. 6. Бюретки на 15–25 мл. 7. Воронки.
Бумажные фильтры.
Работа
7.
ДЕНАТУРАЦИЯ
БЕЛКОВ
Денатурация — это разрушение всех структур белка кроме первич-ной структуры. При денатурации происходит необратимое осаждение белков. Это объясняется развертыванием белковой молекулы и высво-бождением гидрофобных групп, отталкивающих воду, а также хаотиче-ским сближением различных функциональных групп.
Денатурация белков может быть вызвана рядом физических и химических факторов: повышением температуры, взаимодействи-ем с солями тяжелых металлов, концентрированными минеральны-ми кислотами, продолжительным воздействием органических рас-творителей и др.
Денатурация — необратимый процесс. Денатурация белков лежит в основе многих технологических процессов переработки мяса, молока и других белковых объектов.
А.
Денатурация
белков
органическими
растворителями
Добавление смешивающихся с водой нейтральных органических растворителей, например, этанола, ацетона, хлороформа уменьшает растворимость большинства белков в воде и вызывает выпадение их в осадок. Органические растворители снижают диэлектрическую по-стоянную белковых растворов, вследствие чего усиливается притя-жение между белковыми частицами, способствующее агрегации бел-ков и снижению их растворимости. Кроме того, органические рас-творители нарушают гидрофобные взаимодействия внутри белковой молекулы.
Кратковременное воздействие на белки низких концентраций ор-ганических растворителей при низких температурах (+4 ○С) вызыва-ет их обратимое осаждение. Однако длительное воздействие высоких концентраций органических растворителей при относительно высо-ких температурах (+20 ○С и выше) приводит к денатурации белков и необратимому осаждению.
Ход
работы
К 1 мл раствора яичного альбумина добавляют 1,5–2 мл 96%-го эти-лового спирта и встряхивают пробирку. Выпадает осадок белка.
Б.
Денатурация
белков
при
нагревании
Белки подвергаются денатурации и выпадают в осадок при нагрева-нии их растворов до температуры выше 50–60 ○С. Свернувшиеся белки не могут быть снова переведены в раствор, так как при нагревании на-рушаются связи, стабилизирующие четвертичную, третичную и вторич-ную структуры белковых молекул, изменяются их физико-химические свойства, в том числе уменьшается их способность к гидратации.
В изоэлектрическом состоянии при нагревании увеличивается степень денатурации белков. Так как изоэлектрическая точка для большинства бел-ков находится в слабокислой среде, то небольшое подкисление раствора белка способствует более полной его коагуляции при нагревании.
Ход
работы
В две пробирки вносят по 1 мл раствора яичного альбумина. В одну из пробирок добавляют 1 каплю 1%-й уксусной кислоты. Обе пробирки нагревают.
В пробирке с подкисленным раствором свертывание белка происхо-дит быстрее.
Объясняют результаты наблюдений и разницу в появлении осадка в пробирках. Результаты наблюдений вносят в табл. 5.
В.
