скачать книгу бесплатно
1.7. Заключение и этикетирование (маркировка) препаратов
После заключения среза в бальзам и под предметное стекло, т. е. после приготовления так называемого постоянного препарата, он подлежит обозначению – маркировке. Для этого справа и слева от покровного стекла наклеивают этикетки с надписями: слева – описание ткани или органа, объекта, из которого получен материал, справа – метод окрашивания; в необходимых случаях указывают фиксацию материала и дату изготовления препарата.
1.8. Микроскоп и правила работы с ним
Микроскоп – сложный и самый распространенный в биологии и медицине прибор для изучения мелких органов, клеток и тканей организма (рис. 1.3). Наиболее важное значение в нем имеют объективы. Они находятся в непосредственной близости от рассматриваемого объекта, отчего и получили свое название. Объектив состоит из ряда линз, закрепленных в оправе с международной стандартной резьбой в 36 витков в тубусе микроскопа любой оптической фирмы.
Увеличение микроскопа равно произведению цифровых значений объектива и окуляра, скоординированных на тубусе микроскопа, т. е. поставленных друг против друга.
Цена увеличения нанесена на обойме объектива и в верхней линзовой плашке окуляра [в рабочих студенческих микроскопах значения таковы: объектив ?8, ?40, ?90 (иммерсионный); окуляр ?7, ?10].
Общее увеличение светооптического микроскопа равно 2000–2500, однако полезное увеличение, способствующее выявлению деталей объекта, составляет 1500–1600.
Изображение, полученное от простой сферической линзы, направленной непосредственно на рассматриваемый объект, имеет два недостатка: сферическую и хроматическую аберрации, суть которых заключается в следующем.
Известно, что в двояковыпуклой линзе лучи, более удаленные от центра, т. е. центральной оптической оси, сильнее преломляются и пересекают главную оптическую ось на сравнительно близких расстояниях от центра линзы. Лучи, расположенные недалеко от оси, будут преломляться меньше и отдаляются от центра линзы. Таким образом, вместо стигматического точечного изображения возникает расплывчатое пятно. Такая погрешность оптической линзы получила название сферической аберрации.
Рис. 1.3. Световой микроскоп.
1 – окуляр; 2 – объектив; 3 – предметный столик; 4 – источник света.
Количественно сферическая аберрация характеризуется продольной аберрацией – линейным расстоянием между точками пересечения крайних и центральных лучей с главной оптической осью.
Продольные аберрации обусловлены материалом линзы и ее кривизной. В последнем случае аберрации собирательной и рассеивающей линз противоположны по знаку, что позволяет, комбинируя такие линзы в объективе, уменьшить сферическую аберрацию. Это в микроскопах достигается путем набора линз разной значимости в одном объективе.
Кроме сферической, существует хроматическая аберрация, связанная с тем, что волны различной длины преломляются неодинаково: фиолетовые сильнее, красные меньше всего. В результате этого белое пятно будет цветным, окрашенным во все цвета спектра на усредненном экране. Такая наслойка дополнительного цвета на окрашенные гистологические препараты нежелательна и должна быть сведена до минимума. Это достигается комбинацией линз из стекла специального состава. Такая система называется ахроматической и в простом варианте состоит из выпуклой линзы, изготовленной из кронгласа (легкий сорт стекла), склеенной с двояковыпуклой линзой из флинтгласса (тяжелый сорт стекла).
Все объективы микроскопа делятся на ахроматы, в которых устранена аберрация двух наиболее ярких цветов спектра – желтого и зеленого, апохроматы, в которых хроматическая аберрация устранена почти полностью, и полуахроматы; так называемые флюоритовые, занимающие среднее положение между названными объективами.
Для исследования мелких деталей, особенно при цитологических наблюдениях, используют иммерсионные объективы с высокой разрешающей силой.
Чтобы усилить освещенность, в таких системах применяют жидкости, уменьшающие рассеивание света (водная и масляная иммерсия) и заполняющие пространство между верхней поверхностью покровного стекла и передней линзой объектива.
Использование иммерсионного масла, имеющего одинаковый со стеклом и канадским бальзамом коэффициент преломления, создает идеальную гомогенную среду, обеспечивающую возможность различать мельчайшие детали клеток и тканей.
Разрешающей способностью называется способность объектива «разрешить», т. е. показать, наименьшее расстояние между двумя близлежащими деталями предмета, при котором они еще видны раздельно. Она выражается формулой
, где ? – длина световой волны, А – числовая апертура.
Числовая апертура – произведение показателя преломления среды, находящейся между предметом и объективом, и синуса половины угла, образованного двумя крайними лучами, которые еще проходят объектив. Формула ее такова: А = n · sin а, где n – коэффициент преломления среды, ? – значение угла. В цифровом выражении показатель А выгравирован на обойме каждого объектива ниже знака линейного увеличения более мелким шрифтом. Таким образом, исследователь освобожден от необходимости вычисления апертуры по приведенной формуле. При подборе объективов для практических целей необходимо всегда обращать внимание на этот показатель: чем больше числовая апертура, тем выше разрешающая способность объектива, следовательно, и всего микроскопа как прибора, так как окуляр на значение разрешающей силы не влияет, что видно из ранее приведенных формул. Теоретически разрешение светового микроскопа составляет 0,2 мкм, практически оно обычно равно 0,4 мкм.
Приступая к микроскопированию гистологических препаратов, необходимо помнить следующее: всякое исследование надо начинать при малом увеличении для ознакомления с общим видом препарата, расположением тканевых структур различного характера, особенностями их окраски, сочетанием комплексов клеточных структур в различных слоях органа.
При рассеянном искусственном и естественном освещении пользуются вогнутым зеркалом, при точечном источнике света – плоской его поверхностью, регулируя конденсором, особенно при работе с иммерсионными объективами, степень освещенности поля зрения.
Перед переходом на большое увеличение нужную деталь, подлежащую изучению, надо установить при малом увеличении в центре зрения и, не поднимая тубуса микроскопа макрометрическим винтом, плавным движением перевести револьвер на большое увеличение; дальнейшую юстировку (отработка четкости изображения) надо проводить с помощью только микрометрического винта.
Микроскоп нужно содержать в чистоте, после работы вытирать от пыли фланелевой или марлевой салфеткой и предохранять от механических повреждений, не оставлять в местах солнечного освещения или теплового прогревания.
По окончании работы необходимо перевести револьвер микроскопа на малое увеличение, снять с предметного столика препарат, очистить от пыли и грязи сначала оптические, а затем механические части и сдать лаборанту свое рабочее место и все, что было принято перед лабораторной работой.
Глава 2
Строение клетки
Клетка (cellula) – наименьшая структурная единица живого, способная к независимому существованию. Она является основой развития, строения и жизнедеятельности всех животных и растительных организмов.
Главные функции клетки: возбудимость, проводимость, сократимость, поглощение и ассимиляция, дыхание, секреция, экскреция, рост и репродукция.
Клетка состоит из трех основных частей: ядра, цитоплазмы и плазматической мембраны (цитолемма).
Ядро(nucleus) – система генетической детерминации и регуляции белкового синтеза в клетке (рис. 2.1).
Структурные компоненты ядра: хроматин (хромосомы), ядерная оболочка (кариолемма), ядрышко, нуклеоплазма (ядерный сок).
Рис. 2.1. Фибробласт. Ядро. ТЭМ. ?22 000.
1 – ядро; 2 – гетерохроматин; 3 – эухроматин; 4 – ядерное тельце; 5 – кариолемма; 6 – комплекс Гольджи; 7 – митохондрии; 8 – лизосомы; 9 – цистерны гранулярной ЭПС.
Функции ядра: воспроизведение, накопление, хранение и распределение генетического материала (содержит 23 пары ДНК хромосом); регуляция синтеза белка в цитоплазме посредством макромолекул рибосомной РНК (рРНК), информационной РНК (иРНК) и транспортной РНК (тРНК).
Различают эухроматин (слабоокрашиваемый, диспергированный, менее конденсированный, активно участвует в процессах транскрипции), соответствует сегментам хромосом, которые деспирализованы и открыты для транскрипции, и гетерохроматин (хорошо окрашиваемый, конденсированный, не постоянно участвует в процессах транскрипции), соответствующий конденсированным, плотно скрученным сегментам хромосом.
Тельце Бара – скопление гетерохроматина, соответствующее неактивной Х-хромосоме у особей женского пола.
Организация хромосом сложная. Они состоят из спиралей, которые сформированы из гистоновых нуклеосом, образующих сердечники, вокруг которых обернута двойная спираль ДНК.
Молекула ДНК построена из двух антипараллельных цепей с комплементарной последовательностью нуклеотидов. Участок молекулы ДНК, кодирующий последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи, называется геномом.
Ядерная оболочка (nucleolemma) состоит из наружной и внутренней параллельных мембран, разделенных узким перинуклеарным пространством – цистерной, диаметром 10–30 нм. Мембраны продолжаются друг в друга вокруг ядерных пор.
К наружной ядерной мембране прикреплены рибосомы. Наружная мембрана переходит в гранулярную эндоплазматическую сеть (ГЭПС).
Внутренняя ядерная мембрана содержит сеть переплетающихся промежуточных (виментиновых) филаментов, связанных с ядерной пластинкой, к которой прикрепляются интерфазные хромосомы. Ядерная пластинка состоит из переплетенных промежуточных филаментов (ламинов) толщиной 80—100 нм, образующих кариоскелет.
Ядерные поры – это каналы связи диаметром 70—100 нм между ядром и цитоплазмой, их число и распределение изменчивы. Двусторонний транспорт через пору обеспечивается белками экспортинами (транспортируют РНК из ядра) и импортинами (переносят белковые субъединицы рибосом).
Ядерная пора изнутри выстлана специализированными структурами, образующими комплекс ядерной поры.
Комплекс ядерной поры (КЯП) состоит из немембранных структур: белка-рецептора на сигналы ядерного импорта, а также крупных белковых гранул, определяющих границы поры.
Пора ограничена восемью вертикальными белковыми комплексами, которые представляют собой крупные белковые молекулы или компоненты рибосом, находящиеся в процессе транспорта. По горизонтали пора ограничена тремя кольцевидными структурами, располагающимися одна над другой и соединенными вертикально 8 «спицами». Пора содержит также цитоплазменные волокна, транспортер и ядерную корзинку.
Первое кольцо со стороны цитоплазмы имеет волокнистую структуру – специализированный связывающий белок, который тянется в цитоплазму и обеспечивает импорт в ядро различных субстратов.
Среднее кольцо состоит из восьми трансмембранных белковых молекул, которые выбухают и в просвет поры, и в перинуклеарную цистерну. Эти молекулы прикрепляют гликопротеиновые компоненты КЯП к наружному ободку поры. Центр среднего кольца занят «транспортером», прикрепленным к периферическим белкам среднего кольца.
Третье кольцо со стороны нуклеоплазмы аналогично по строению первому. От него в сторону нуклеоплазмы отходит ядерная корзина, которая деформируется при транспорте веществ через пору.
Ядрышко (nucleolus) – хорошо определяемое только в интерфазе ядерное образование (одно или несколько), наблюдаемое в клетках, активно синтезирующих белок. Под электронным микроскопом в ядрышке выделяют три типичных компонента: фибрилшрный компонент, состоящий из тонких, диаметром 5–8 нм, нитей (совокупность первичных транскриптов – предшественников рРНК); гранулярный компонент – скопление плотных частиц диаметром 10–20 нм (поздние стадии образования предшественников рРНК); аморфный компонент, представляющий собой связанный с ядрышком хроматин, состоящий из ДНК в области ядрышкового организатора хромосомы.
Фибриллярный и гранулярный компоненты ядрышка образуют ядрышковую нить (нуклеолонема) толщиной 60–80 нм, формирующую в пределах ядрышка широкопетлистую сеть.
Ядрышко участвует в синтезе рРНК и формировании предшественников рибосомальных субъединиц. Размеры и число ядрышек увеличиваются при повышении функциональной активности клетки.
Плазматическая мембрана (плазмолемма, клеточная мембрана) окружает клетку и ограничивает ее от внешней среды; обеспечивает распознавание клеткой других клеток, а также взаимодействие с межклеточным веществом (прикрепление к его элементам, взаимодействие с сигнальными молекулами: гормонами, медиаторами, цитокинами и др.); регулирует движение ионов и макромолекул из клетки и в клетку (селективная проницаемость), осуществляет активный и пассивный транспорт веществ (эндоцитоз – фагоцитоз и пиноцитоз, экзоцитоз); обеспечивает механическое и химическое взаимодействие между клетками, а также движение клетки (образование псевдо-, фило– и ламеллоподий).
Молекулярное строение плазматической мембраны описывается жидкостно-мозаичной моделью, согласно которой она состоит из двойного фосфолипидного слоя, внутри которого распределены интегральные и периферические белки; гидрофильные концы фосфолипидов обращены наружу, гидрофобные цепи – внутрь; между хвостами противолежащих молекул фосфолипидов имеются слабые гидрофобные связи.
При замораживании – скалывании плазмолемма расщепляется вдоль так, что большая часть интегральных белков отходит к внутреннему листку (Р-поверхность, или протоплазматическая) и только некоторые – к наружному (Е-поверхность, или наружная).
Белки занимают разное положение в бислое, составляя более 50 % от массы мембраны. Некоторые белки прикреплены к мембране с помощью специальных компонентов цитоскелета (интегральные белки), другие передвигаются к поверхностям мембраны (трансмембранные белки – белки-переносчики, белки мембранных насосов, белки ионных каналов).
В плазмолемме присутствуют также гликолипиды, участвующие в межклеточных взаимодействиях, холестерин, обеспечивающий стабильность ее структуры, а также молекулы углеводов, соединенные либо с гликолипидами, либо с интегральными белками и действующие как рецепторы химического взаимодействия между клетками (например, рецепторы гормонов). В составе плазмолеммы имеются также интегрины – трансмембранные белки, служащие рецепторами для внеклеточных макромолекул (фибронектина и ламинина), которые обеспечивают связь клетки с внеклеточным матриксом.
Гликокаликс (поверхностная оболочка) находится на внешней поверхности плазматической мембраны. Он сформирован олигосахаридными компонентами интегральных гликопротеинов мембраны и гликолипидами, придает отрицательный заряд поверхности клетки, играет роль в иммунологической специфичности, содержит антигены групп крови, участки-рецепторы, а также служит защитным механическим барьером. В клетках тонкой кишки гликокаликс содержит ферменты, гидролизующие дисахариды и полипептиды, участвующие в пищеварении.
Подмембранный (кортикальный) слой плазмолеммы образован упорядоченной сетью поперечно связанных белковых нитей из актина и актинсвязанных белков (прежде всего филамина), которая выстилает изнутри Р-поверхность плазматической мембраны.
Через плазмолемму постоянно осуществляется трансмембранный транспорт, который бывает пассивным и активным.
Пассивный транспорт происходит без затрат энергии, за счет градиента концентрации, и включает простую и облегченную диффузию. Простая диффузия – перенос мелких неполярных молекул (кислород, азот, углекислый газ, бензол) и незаряженных полярных молекул (вода, глицерин) по градиенту концентрации. Облегченная диффузия – прохождение большинства ионов и мелких молекул через мембрану по специальным белковым каналам или с помощью белков-переносчиков.
Активный транспорт является энергоемким процессом, в котором перенос более крупных молекул осуществляется с помощью белков-переносчиков против градиента концентрации ионов, с активным участием плазмолеммы (эндо– и экзоцитоз).
Эндоцитоз включает пиноцитоз – перенос жидкости и мелких молекул диаметром 60—100 нм (неселективный и селективный) и фагоцитоз – поглощение веществ с образованием крупных эндосом (диаметром 250 нм и более).
Неселективный эндоцитоз осуществляется путем инвагинации участка плазмолеммы с последующим слиянием его краев и образованием эндосомы. Слияние мембран происходит с образованием активного фузогенного комплекса (ФК). ФК образуется при взаимодействии специального N-этилмалеимидчувствительного белка слияния (NSF) и связывающего белка (SNAPS).
Селективный эндоцитоз, или рецепторно-опосредованный эндоцитоз, – более эффективный способ эндоцитоза (перенос гормонов, фагоцитоз лейкоцитами бактерий), опосредованный путем связывания мембранных рецепторов с молекулами поглощаемого вещества с образованием окаймленных пузырьков и кавеол.
Участок мембраны, несущий рецепторы с макромолекулами поглощаемого вещества – лигандами, формирует окаймленную ямку, которая окружается гексагональной корзиной из окаймляющего белка клатрина. Клатринная корзина усиливает инвагинацию, превращая ямку в окаймленный пузырек (ОП). Как только ОП «проваливается» в цитоплазму, клатрин сбрасывается с его поверхности и возвращается на поверхность клетки, снова встраиваясь в плазмолемму, а содержимое ОП подвергается процессингу (переваривание).
Экзоцитоз – это выведение продуктов из клетки без нарушения целостности плазмолеммы. Избыток мембраны удаляется при экзоцитозе, что предотвращает бесконечное увеличение поверхности клетки.
Трансцитоз характерен для некоторых типов клеток, например эндотелиоцитов стенок кровеносных сосудов, особенно капилляров. Он объединяет признаки эндоцитоза и экзоцитоза. Трансцитоз заключается в том, что на одной поверхности клетки формируется эндоцитозный пузырек, который переносится к противоположной ее поверхности и, становясь экзоцитозным пузырьком, выделяет свое содержимое во внеклеточное пространство.
Цитоплазма – второй важнейший компонент клетки, в котором располагаются все органеллы (рибосомы, матохондрии, комплекс Гольджи и т. д.) и совершаются физиологические процессы.
Рибосомы (ribosomae) – плотные немембранные органеллы, представляющие собой частицы рибонуклеопротеина (рРНК и ряд белков) размером 12 х 25 нм, состоящие из асимметричных большой и малой субъединиц. Они часто группируются вдоль нити иРНК, формируя полисомы; соединившись с иРНК, синтезируют белок.
Рибосомы и полисомы могут быть свободными (синтезируют белки для клетки) или фиксированными на мембранах ЭПС (синтез белка для выделения из клеток).
Гранулярная ЭПС – система трубочек и цистерн, окруженных мембраной, снаружи усеянной рибосомами. Она обеспечивает биосинтез всех мембранных белков и белков, предназначенных для экспорта из клетки, а также начальное гликозилирование и посттрансляционные изменения белковых молекул.
В ГЭПС различают внутреннюю часть (цистерну), содержащую продукты синтеза, и рецепторы (специфические гликопротеины, рибофорины) на мембранах, к которым прикрепляются большие субъединицы рибосом.
иРНК располагается между малой и большой субъединицами рибосомы; наблюдается в клетках, синтезирующих белки «на экспорт» (гландулоциты слюнных желез, желез пищеварительного тракта и др.).
Агранулярная (гладкая) ЭПС – нерегулярная, неправильной формы сеть анастомозирующих трубочек, канальцев, цистерн и везикул диаметром 20—100 нм, окруженных мембранами без рибосом. Она выполняет функции небелкового синтеза (углеводы, липиды, холестерин), синтеза стероидных гормонов, детоксикации лекарств, обмена жиров и холестерина, выделения и обратного поглощения ионов кальция во время сокращения и расслабления миофибрилл.
Переходная (транзиторная) ЭПС – участок перехода ГЭПС в АЭПС у формирующейся поверхности комплекса Гольджи, в котором цистерны распадаются на отдельные окаймленные транспортные пузырьки, переносящие материал из ГЭПС в комплекс Гольджи.
Митохондрии (mitochondriones) – палочковидные, различимые в световом микроскопе мембранные полуавтономные органеллы длиной 2—10 мкм и шириной 0,2–2,0 мкм (рис. 2.2). Они построены из наружной и внутренней мембран, разделенных межмембранным пространством (матрикс).
Рис. 2.2. Фрагмент клетки. ТЭМ. ?20 000.
1 – ядро; 2 – митохондрии; 3 – лизосомы; 4 – комплекс Гольджи; 5 – цистерны гранулярной ЭПС.
Наружная мембрана окружает всю органеллу, содержит много молекул специализированных транспортных белков (поринов), а также небольшое количество рецепторов и ферментных систем.
Внутренняя мембрана формирует кристы, содержащие ферментные комплексы цепи переноса электронов, которые участвуют в окислительном фосфорилировании. В ее состав входят белки 3 типов: 1) транспортные, 2) ферменты дыхательной цепи и сукцинатдегидрогеназа, 3) комплекс АТФ-синтетазы.
Кристы – это складки внутренней мембраны толщиной 18–20 нм. На них находятся элементарные (грибовидные) частицы – оксисомы, или F
-частицы, состоящие из головки диаметром 8–9 нм и ножки толщиной 2–3 нм, на которых происходит сопряжение процессов окисления и фосфорилирования.
Большинство крист по форме пластинчатые (ламеллярные), в некоторых клетках (клетки коркового вещества надпочечника, желтого тела яичника и др.) они имеют форму пузырьков и трубочек (тубулярно-везикулярные кристы).
Матрикс (внутренняя среда) содержит гранулы, которые связывают двухвалентные катионы (магния и кальция). В матриксе находятся ферменты цикла Кребса, ферменты белкового синтеза и окисления жирных кислот.
Митохондрии имеют собственный генетический аппарат из ДНК (кольцевой формы), иРНК, тРНК и рРНК (с ограниченной способностью к кодированию), поэтому большинство белков митохондрий кодируются ядерной ДНК. Они производят аденозин-трифосфат (АТФ) – главный и первичный запас энергии в клетке. Это энергетические станции клетки.
Жизненный цикл митохондрий – около 9—10 сут, их разрушение происходит путем аутофагии, а образование новых – путем перешнуровки предсуществующих.
Комплекс Гольджи (КГ) – мембранная органелла, которая состоит из нескольких дисковидных мешочков (цистерн), собранных в стопку, не анастомозирующих между собой, а также пузырьков и вакуолей (рис. 2.3).
Другая сторона стопки образует внешнюю вогнутую поверхность (транс-поверхность, или поверхность созревания).
Рис. 2.3. Комплекс Гольджи. ?300.
1 – нейроцит (псевдоуниполярный); 2 – ядро; 3 – ядрышко; 4 – комплекс Гольджи; 5 – олигодендроглиоцит.
Мелкие везикулы диаметром 40–80 нм (включая транспортные везикулы ЭПС) связаны с внутренней выпуклой цис-поверхностью, а конденсированные вакуоли – секретированные вещества, конденсированные в гранулы, – с внешней транс-поверхностью.
В зависимости от типа клетки и ее активности размеры и степень развития КГ варьируют.
Функции КГ: переработка и перераспределение мембран; синтез полисахаридов и гликопротеинов; модификация продуктов ЭПС путем прибавления жирных кислот, сульфатирования, гликозилирования; концентрация и упаковка синтезированных веществ в секреторные гранулы; участие в образовании лизосом.
Лизосомы (lysosomae) – плотные органеллы, окруженные одинарной мембраной (см. рис. 4.2). Они содержат около 60 гидролитических ферментов (протеазы, нуклеазы, липазы, гликозидазы, фосфорилазы, фосфатазы, сульфатазы), активно участвующих во внутриклеточном пищеварении. Лизосомы могут быть обнаружены по позитивной реакции на кислую фосфатазу.
Первичные лизосомы – вновь образованные тельца, еще не принимавшие участия в пищеварении.
Вторичные лизосомы – органеллы, в которых происходит переваривание; они имеют различное происхождение. Различают следующие разновидности лизосом:
– гетерофагическая вакуоль, или фаголизосома, формируется, когда вещества, поглощенные из внешней среды, изолируются в фагосоме, которая сливается с первичной лизосомой;
– аутофагическая вакуоль, или аутофагосома, образуется, когда органелла, подлежащая разрушению, окружается мембранами ГЭПС, которые формируют вакуоль, сливающуюся с первичной лизосомой;
