скачать книгу бесплатно
Цервицит
Юрий Викторович Трусов
Представленный материал отражает современное представление о причинах инфекционного и неинфекционного цервицита, его диагностике, вариантах течения и наиболее целесообразной терапии на основе данных доказательной медицины. Пособие предназначено для врачей акушеров-гинекологов.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БВ – бактериальный вагиноз
ВЗОМТ – воспалительные заболевания органов малого таза
ВИЧ – вирус иммунодефицита человека
ВМС – внутриматочная спираль
ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения
ВПГ – вирус простого герпеса
ВПЧ – вирус папилломы человека
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ЗТ – зона трансформации
ИППП – инфекции, передающиеся половым путём
ИФА – иммуноферментный анализ
ИФН – интерферон
ЛПС – липополисахарид
ЛПУ – лечебно-профилактическое учреждение
МАНК – метод амплификации нуклеиновых кислот
МПЭ – многослойный плоский эпителий
ПИФ – прямая реакция иммунофлюоресценции
ПЦР – полимеразная цепная реакция
РТ – ретикулярные тельца
РИФ – реакция иммунофлюоресценции
РНИФ – реакция непрямой иммунофлюоресценции
РСК – реакция связывания комплемента
УЗИ – ультразвуковое исследование
ЦМВ – цитомегаловирус
ЦЭ – цилиндрический эпителий
ЭТ – элементарные тельца
ВВЕДЕНИЕ
Настоящее учебное пособие имеет структуру, отражающую различие во врачебной тактике при цервицитах.
Первый («традиционный») подход распространён как в России, так и за рубежом и предусматривает лечение цервицита после лабораторной идентификации возбудителя этого заболевания. Последняя напрямую зависит от свойств микроорганизма, поэтому методы диагностики причины цервицита рассмотрены в разделе о его этиологической структуре. Причём при описании молекулярно – биологических методов выявления хламидий дана характеристика всем известным МАНК. Не меньше внимания уделено методу ИФА, получившему широкое распространение в деятельности ЛПУ.
Несмотря на то, что лечением гонореи и трихомоноза занимаются венерологи, рост частоты этих заболеваний за рубежом и уменьшение частоты их встречаемости в России, стёртость и атипичность их современного течения позволяют предположить, что акушеры – гинекологи ослабили профессиональное внимание к выявлению этих нозоологических форм. Отдельный акцент сделан на оппортунистических цервицитах, когда сам факт выделения вирусного, микоплазменного, уреаплазменного характера цервицита или его реализация при кандидозе указывает на наличие выраженного вторичного иммунодефицита у пациентки и подвигает к проведению комплексной антибактериально – иммунокоррегирующей терапии.
Сторонники второго (эмпирического) подхода считают нецелесообразным проводить лабораторную идентификацию возбудителя, а назначают лечение сразу с перекрытием спектра наиболее часто встречающихся возбудителей цервицита, прежде всего, хламидий и гонококков. Мотивируется эта позиция, прежде всего клинической основой диагноза «цервицит», эпидемиологическими данными, экономической выгодой и лёгкостью лечения для пациента (короткий курс – разовый приём). В России такой принцип пробного лечения (лечения, действующего на предполагаемую причину заболевания) известен давно и используется для диагностических целей. В настоящее время, прежде всего, в США он оформился в самостоятельный методический подход в лечении цервицитов.
При рассмотрении лечения в заключительном разделе особое внимание уделено иммунокоррекции у пациенток с цервицитами в силу их доказанной эффективности.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
В Малой медицинской энциклопедии (1991-1996) цервицит (cervicitis; лат. cervix, cervicis – шея, шейка + -itis) определяется как воспаление шейки матки.
1.ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА ЦЕРВИЦИТОВ
1.1.Chlamydia trachomatis
Хламидии близки по структуре и химическому составу к классическим бактериям. Для них характерно сохранение морфологической сущности на протяжении всего жизненного цикла, деление вегетативных форм, наличие клеточной стенки, содержание ДНК и РНК, энзиматическая активность, чувствительность к антибиотикам широкого спектра действия, наличие общего родоспецифического антигена.
В то же время, хламидии по размерам меньше классических бактерий, имеют небольшой геном, являются облигатными внутриклеточными паразитами с уникальным циклом развития. Они не способны синтезировать высокоэнергетические соединения и обеспечивать собственные энергетические потребности, что и определяет их облигатный паразитизм.
Морфологические особенности. Клеточный цикл развития хламидий имеет две основных формы – элементарные тельца (ЭТ) – инфекционная форма и ретикулярные тельца (РТ) – вегетативная форма. ЭТ значительно меньше РТ по размеру (менее 300 нм в диаметре), имеют более жесткую электронно – плотную структуру, метаболически малоактивны, адаптированы к кратковременному внеклеточному существованию.
Цикл развития хламидий осуществляется в цитоплазматическом включении – фагосоме (вакуоли), куда ЭТ попадают путем стимулирования эндоцитоза. В процессе адсорбции и эндоцитоза (7 – 10 часов) участвуют термолабильные эффекторные белковые поверхностные антигены хламидий. ЭТ подавляют фагосомо – лизосомальное слияние и преобразуются в течение 6 – 8 часов при участии главного поверхностного протеина в РТ. Последние обладают активным метаболизмом, более крупными размерами и активным бинарным делением. Репродукция хламидий на протяжении 18 – 24 часов осуществляется в цитоплазматическом пузырьке, образованном из мембраны клетки хозяина, вмещающем в себя от 100 до 500 ЭТ. Далее в течение 36?42 часов происходит процесс созревания РТ через переходные (промежуточные) тельца в ЭТ следующего поколения. Полный цикл развития хламидии равен 48?72 часам и завершается разрушением пораженной клетки. В случае возникновения неблагоприятных метаболических условий этот процесс затягивается, могут образовываться L – формы.
Культуральные свойства. Для выращивания хламидий используются ткани лабораторных животных и куриные эмбрионы, особенно, линии клеток McCoy чаще с обработкой цитостатиками для повышения их чувствительности.
Биохимические свойства. Chlamydia trachomatis способна самостоятельно синтезировать нуклеиновые кислоты, некоторые белки и липиды, является энергетически зависимыми от хозяина эндопаразитом, обладает гликоген – синтетазной системой (гликоген содержится и выявляется при определенных методах окраски во включениях), синтезирует предшественники фолиевой кислоты и в соответствии с биохимической активности чувствительна к сульфаниламидам.
Антигенная структура. 1. Хламидии выделяют поверхностный родоспецифический антиген (по химическому составу – липополисахарид), локализующийся на наружной мембране клеточной стенки. Он имеет две антигенные детерминанты, одна из них специфична для всего рода, другая перекрестно реагирует с некоторыми другими грамотрицательными бактериями (сальмонеллы серовара minnesota), термостабилен. 2. МОМР (Major Outer Membrane Protein) – главный белок наружной мембраны хламидий исполняет роль структурного белка и порина, включает термолабильные белковые детерминанты, обладающие видо – , типо – и сероварной специфичностью.
Детерминанты патогенности. 1. Эндотоксин (липополисахарид), подобный эндотоксинам грамотрицательных бактерий. 2. Экзотоксины – термолабильные субстанции. 3. Антигены клеточной поверхности, подавляющие защитные реакции. Факторы патогенности хламидий препятствуют фагосомо – лизосомальному слиянию в фагоцитах.
Краткая эпидемиологическая характеристика. В крупных странах (США, Россия) ежегодно регистрируют несколько миллионов случаев заболеваний, вызываемых Chlamydia trachomatis сероваров D – K, в мире – от 50 до 90 млн. случаев. Этот возбудитель передаётся от человека к человеку половым путем, от матери к плоду при его рождении. Бессимптомное носительство наблюдается не менее чем у 10% женщин. При беременности инфицировано 7% женщин.
Распространение инфекции:
а) каналикулярно, то есть через цервикальный канал, полость матки, маточные трубы на брюшину и органы брюшной полости (в распространении хламидий могут участвовать сперматозоиды);
б) лимфогенно – по лимфатическим капиллярам;
в) гематогенно – о чем свидетельствуют экстрагенитальные поражения (глотка, суставные сумки).
Лабораторная идентификация.
Цитологический метод – окраска препаратов из клинических материалов по Романовскому-Гимза, по Гименезу, по Макиавелли, окраска раствором Люголя. Для постановки предварительного диагноза хламидиоза достаточно обнаружить одно типичное цитоплазматическое включение. Одновременно учитывается количество лейкоцитов как показателя воспаления, а также дополнительная информация о наличии сопутствующей бактериальной микрофлоры (дрожжеподобных грибов, трихомонад и т.п.). Чувствительность метода составляет 10-20%.
Культуральный метод – выделение хламидий на клеточных линиях L-929, Mс Coy, Hela, куриных эмбрионах и др. Для его осуществления необходима быстрая транспортировка клинического материала на холоде (6+2°С), чтобы сохранить жизнеспособность находящихся в нём хламидий. Кроме того, выделение последних не стандартизировано и продолжительно, затруднено при использовании пациенткой любрикантов, спринцеваний, спермицидов или при заборе материала для исследования тампоном, содержащим вату, дакрон. Чувствительность метода, по данным разных авторов, колеблется в пределах 40 – 70%, но специфичность метода остается 100%. Результаты культурального исследования получают через 2-3 дня. Последний считается положительным, если обнаруживается хотя бы одно хламидийное внутрицитоплазматическое включение и нет причин подозревать контаминацию другим положительным образцом.
Иммунологические методы.
Прямая иммунофлюоресценция (ПИФ): выявление антигенов хламидий путем обработки препаратов меченными флюоресцеином моноклональными антителами к родоспецифическим и видоспецифическим антигенам этого инфекционного агента и люминисцентной микросопии: на красном или оранжевом фоне цитоплазмы эпителиальных клеток определяются округлые яблочно-зеленые элементарные тельца 200-300 нм. Требуется более 5 клеток цилиндрического эпителия в одном поле зрения. Диагностическая ценность ПИФ связана с тем, что с ее помощью выявляются не только корпускулярные, но и растворимые антигены хламидий. Этот метод не зависит от возможного изменения тинкториальных свойств микроорганизма в процессе заболевания и лечения. При использовании моноклональных антител результат считают положительным при наличии 10 ЭТ в поле зрения или хотя бы одного внутриклеточного включения. ПИФ – важный скрининговый метод диагностики хламидиоза. Чувствительность и специфичность метода составляют, соответственно, 55-76% и 98%. Чувствительность метода низкая при малых количествах элементарных телец в препарате.
Непрямая иммунофлюресценция (НИФ) применяется в тех случаях, когда нет в наличии антихламидийных антител. В этих случаях приготовленный тем же методом, что и для ПИФ препарат из клинических проб обрабатывают вначале антихламидийными антителами, полученными путем иммунизации хламидиями овец, кроликов, мышей или других животных, а затем второй сывороткой, специфичной для вида животного, которое было иммунизировано хламидиями. Антитела второй сыворотки конъюгированы с ФИТЦ. Показания к применению и специфичность данного метода совпадают с ПИФ.
Иммуноферментный анализ для определения антигена (ИФА-АГ) хламидий с использованием моноклональных антихламидийных антител варьирует от прямого обнаружения антигена до захвата антигена с использованием или без использования ферментной амплификации с целью увеличения чувствительности метода. Чувствительность и специфичность метода – от 20 до 85% и зависят от вида тест-системы и перекрёстного реагирования с липополисахаридом (антигеном) других микроорганизмов. Результат исследования определяют с помощью специальных ридеров, позволяющих определять оптическую плотность образца при определенной длине волны (обычно – при 492 нм). Образцы, дающие значения оптической плотности выше или равные значениям отсекающего поглощения (cut-off), считаются положительными.
Иммунохроматографический анализ и и ферментоспецифическая реакция выявляют в исследуемом материале антигены хламидий у постели больного (Bed Side) при скрининговых исследованиях: накопление в зоне учета результатов реакции иммунных комплексов, содержащих метки, приводит к образованию окрашенной полосы (розового цвета различной интенсивности), учитываемой визуально. Широкое применение тестов ограничивается ввиду недостаточно высокой чувствительности и специфичности по сравнению с методами амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) хламидий.
Метод выявления антител к C. Trachomatis (серологический). ИФА на наличие антител: антиген фиксируется на твердой поверхности, обрабаты-вается испытуемой сывороткой, а затем антивидовым иммуноглобулином, связанным с ферментом, визуализирующимся после добавления субстрата. Следует учитывать, что у некоторых людей иммунный ответ на урогенитальную хламидийную инфекцию может быть отсрочен или даже отсутствовать после инфицирования. В случаях, где иммунный ответ есть, антитела часто сохраняются в течение длительного времени после выздоровления. По этим причинам для диагностики отдельных случаев хламидиоза этот метод не рекомендуется, но может быть использован при оценке фазы заболевания путём регистрации определённых классов иммуноглобулинов к специфическому хламидийному липополисахариду: первичная / острая (Ig G, Ig A, Ig M), хроническая (Ig A, Ig G), реактивация или реинфекция (Ig A, Ig M), состояние после реконвалесценции (Ig G). Следует учесть, что при недостоверном определении титра IgA подтверждение осуществляется при помощи определения Ig M. IgM является маркером острой стадии заболевания и определяется уже через пять дней после его начала. В течение 10?ти дней после появления патологических симптомов происходит смена IgM на IgA, незначительное время могут одновременно присутствовать Ig M и Ig A. В это же время или с небольшой задержкой в 2?3 недели могут быть определены и IgG. Переход в хроническую стадию болезни характеризуется появлением Ig A, Ig G- антител.
Для адекватной интерпретации результатов серодиагностики хламидиоза следует определять такое понятие как “пограничные титры”. Это – наименьшие возможные разведения, в которых тест-системы определяют антитела против хламидии. “Пограничные титры” для IgM – 1:50, IgA – 1:50, IgG – 1:100. Так называемые “диагностические титры” могут подтверждать клинический диагноз, стадию процесса, необходимость назначения антибактериального лечения (табл.1). При реинфекции и реактивации происходит cкачкообразный подъем титров IgG, изменения титра IgA идут параллельно с титром IgM, однако на более низком уровне. У лиц, не получающих в период реинфекции лечения, титр IgG cохраняется на неизменном уровне. Выявление на протяжении длительного периода титра только IgG указывает на состояние реконвалесценции после перенесенной хламидийной инфекции (“серологические шрамы”). Исследуя титры антител IgG, IgA, IgM, можно оценивать эффективность проведенного лечения в отдаленном периоде (через 1?1,5 месяца).
Таблица 1
Диагностический диапазон титров антител IgG, IgA, IgM при хламидиозе
Стадия заболевания
Дипазон титров IgG
Диапазон титров IgA
Диапазон титров Ig M
Первичная/острая
Определяются Ig M
>100?6400
> 50?1600
> 50?3200
Хроническая
Определяются Ig А
>100?1600
>50?200
<50
Реактивация/Реинфекция
Определяются Ig G, IgA
>100?51200
>50?400
<50
Состояние после Реконвалесценции
Определяется IgG
>100?400
<50
<50
Молекулярно – биологические методы – методы на основе амплификации (лат. amplificatio – усиление, увеличение), нуклеиновых кислот: процесс образования дополнительных копий участков хромосомной ДНК сигнала, мишени и зонда.
При использовании методов амплификации сигнала, в ходе реакции увеличения концентрации мишени или зонда не происходит. Значительное повышение аналитической чувствительности метода достигается за счет связывания с мишенью множества меченых молекул. Один из вариантов этого подхода (hybrid capture assay – метод захвата гибридных молекул) используется в коммерческих тест-системах для выявления C. trachomatis. Метод основан на гибридизации в растворе ДНК-мишени и РНК-зонда. Образовавшиеся гибридные молекулы захватываются иммобилизованными антигибридными антителами. Затем к иммобилизованным гибридным молекулам присоединяются антигибридные антитела, меченные щелочной фосфатазой. Реакция оценивается по интенсивности люминесценции, ее высокая чувствительность определяется тем, что к одной гибридной молекуле (ДНК+РНК) присоединяется множество молекул меченых антител.
Амплификация зонда. При использовании этих методов продукт амплификации представлен только нуклеотидными последовательностями, входящими в состав зонда. Наиболее известным вариантом этого метода является лигазная цепная реакция.
Амплификация мишени. Все методы, относящиеся к этой группе, основаны на проведении энзиматических реакций, в процессе которых один или несколько ферментов синтезируют множественные копии нуклеиновой кислоты – мишени.
Классическая ПЦР. Амплификация ДНК-мишени осуществляется в ходе повторяющихся циклов, каждый из которых включает денатурацию ДНК-мишени при температуре более 900С, отжиг на каждой одноцепочечной молекуле ДНК комплементарного праймера (олигонуклеотида) при понижении температуры до 550С – 650С, достройку двухцепочечной молекулы ДНК с каждого праймера в результате энзиматической активности термостабильной ДНК-полимеразы. По окончании цикла происходит удвоение фрагментов ДНК-мишени. Для детекции продуктов амплификации используются электрофоретический и гибридизационно-флуоресцентный методы.
ПЦР в реальном времени позволяет предотвратить перекрестную контаминацию исследуемых образцов, которая свойственна классической ПЦР, благодаря её высокой чувствительности. Для детекции продуктов амплификации разработаны технологии, основанные на комплексе ферментативных реакций, в результате которых в реакционной смеси возникает флюоресцентный сигнал, по интенсивности пропорциональный количеству образовавшегося продукта амплификации. ПЦР в реальном времени может быть использована для определения количественного содержания ДНК-мишени в биологическом образце.
Методы амплификации, основанные на транскрипции, реализуются при постоянной температуре, а мишенью является РНК хламидий. На начальных этапах реакции при участии обратной транскриптазы на матрице РНК – мишени происходит синтез комплементарной ДНК. Затем с помощью РНК полимеразы синтезируются множественные копии РНК. В настоящее время распространены амплификация, основанная на транскрипции (TMA – Transcription Mediated Amplification) и амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA – Nucleic Acid Sequence Based Amplification), различающиеся происхождением используемых в реакциях ферментов и методами детекции продуктов амплификации.
Метод амплификации со смещением цепочки относится к изотермическим, концептуально сложен, но технически прост в исполнении и наиболее часто используется для детекции не только хламидий, но и гонококков. Следует заметить, что в Скандинавии появились варианты C. trachomatis, у которых в результате мутации отмечено отсутствие участка криптической плазмиды C. trachomatis, являющейся мишенью для данного метода.
Таким образом, для постановки диагноза урогенитальной хламидийной инфекции рекомендуeтся использовать валидные и разрешенные к применению методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) и не рекомендуются использование культурального метода и методов основанных на выявлении антигенов хламидий или антител к ним, экспресс-тесты у постели больного. Наиболее информативным может быть клинический материал, если он получен при наличии клинических признаков заболевания, отсутствии использования лекарственных препаратов местно минимум в течение последних 48 – 72 часов, в середине менструального цикла в дни, когда нет кровянистых выделений.
Если, например, при ПЦР в реальном времени обнаруживается 469 копий / мл и выше, то концентрация хламидий считается диагностически значимой и назначается этиотропная и иммунокорригирующая терапия. В противном случае (при концентрации хламидий 100 – 498 копий / мл ) результат исследования признаётся сомнительным и требуется применение культурального метода. В последнем случае окончательно решается: есть инфицирование хламидиями или нет. При этом скрининговые методы (ИФА, ПИФ) могут выступать при положительной детекции хламидий своеобразными «поставщиками» клинических образцов для дальнейшего исследования МАНК. Последние решают проблему низкой чувствительности культурального метода, но не могут его заменить при определении чувствительности хламидий к антибиотикам.
Получение клинического образца. Оптимальным для присутствия и размножения хламидий являются определенные участки цилиндрического эпителия: слизистая оболочка цервикального канала на глубине 1,5 см. При взятии материала из этой зоны ключевым моментом является удаление слизистой пробки. От тщательности проведения этой подготовительной процедуры во многом зависит правильность соскоба клеток цервикального канала. Слизистую пробку удаляют ватным тампоном и пинцетом, а затем берут материал специальной щеточкой cervix brush / voba-brush или ложечкой Фолькмана. Для получения репрезентативного результата важно присутствие в образце клеток со всей поверхности цервикального канала и зоны трансформации. Щеточка вводится в канал на 1?2 см и вращается 15 секунд .
Забор материала у девочек производится со слизистой оболочки преддверия влагалища, в отдельных случаях – из заднего свода влагалища через гименальное кольцо.
