Сергей Бабичев.

Медицинская микробиология, иммунология и вирусология



скачать книгу бесплатно

Инициирующие кодоны и инициаторная транспортная РНК

Рост полипептидной цепи на рибосоме происходит таким образом, что каждая новая пептидная связь образуется между карбоксильной группой предшествующего и аминогруппой присоединяемого аминокислотных остатков, т. е. в направлении COOH?NH2. Поэтому у первой (начальной) аминокислоты полипептидной цепи свободной будет NH2-группа, ее обозначают как N-концевую аминокислоту, а у последней остается свободной COOH-группа (C-концевая аминокислота).

Биосинтез белка у прокариот и эукариот происходит таким образом, что N-концевое положение в полипептидной цепи всегда занимает метионин. Иначе говоря, синтез белка начинается с включения метионина – инициаторной аминокислоты. Для транспорта инициаторной аминокислоты, т. е. метионина, когда он занимает N-концевое положение, используется специальная строго специфическая инициаторная тРНК – тРНКф-мет. Она отличается от той тРНКмет, которая поставляет метионин в любое другое место полипептидной цепи, тем, что переносит его только в N-концевое положение. У бактерий после связывания метионина с инициаторной тРНК группа NH2 аминокислоты с помощью особого фермента формилируется, т. е. соединяется с формильным остатком ( – CHO), который ее блокирует. Причем фермент узнает не просто метионин, а особую структуру специфической инициаторной тРНК, с которой метионин уже связан. Таким образом, тРНКф-мет отличается от обычной тРНКмет, которая также акцептирует метионин, но без последующего его формилирования.

У эукариот инициаторной аминоацил-тРНК является особая метионил-тРНК с неблокированной NH2-группой.

Триплетами, кодирующими присоединение инициаторных аминокислот (формилметионил-тРНК и метионил-тРНК), являются АУГ и ГУГ, получившие название инициаторных кодонов. Однако они выполняют функцию инициирующего кодона лишь в том случае, когда являются начальными триплетами при считывании мРНК. Их роль как инициаторных кодонов определяется рибосомами благодаря особой вторичной структуре, которая образуется на мРНК в районе расположения этих триплетов. Если же эти кодоны располагаются внутри цепи мРНК, то каждый из них распознается как кодон для метионина (АУГ) или валина (ГУГ).

Инициация трансляции

Под инициацией трансляции понимают процесс формирования функционально активного комплекса рибосома 70S – мРНК, постановки формилметионил-тРНК на Р-участок рибосомы и освобождения А-участка для очередной аминоацил-тРНК. В результате вся белоксинтезирующая система переводится в состояние, позволяющее соединять аминокислоты в полипептидную цепь в той последовательности, которая задается мРНК.

В образовании инициаторного комплекса принимают участие: мРНК с инициирующим кодоном АУГ (ГУГ); обе субъединицы (30S и 50S); белковые факторы инициации (IF-1, IF-2, IF-3), фактор ассоциации (AF); формилметионил-тРНК и ГТФ. Процесс инициации складывается из нескольких стадий, катализируемых белковыми факторами инициации.

Каждая 70S рибосома собирается на мРНК из двух субъединиц 30S и 50S. Вначале присоединяется 30S субъединица, предварительно нагруженная инициаторной тРНК, узнающей инициаторный кодон АУГ и несущей метионин. Этот процесс катализируется IF-2. 30S субъединица присоединяется к инициаторному кодону путем спаривания антикодона соединенной с ней инициаторной тРНК с инициаторным кодоном АУГ мРНК. В молекуле мРНК обычно имеется много кодонов АУГ, и каждый из них кодирует метионин. Выбор инициаторного кодона АУГ облегчается особой структурой бактериальной мРНК (см. рис. 21). Инициаторным кодоном всегда служит АУГ, ближайший к 5'-НТП. После завершения этого процесса все факторы инициации, остававшиеся до этого момента связанными с 30S субъединицей, отделяются от нее, к ней присоединяется 50S субъединица, и формируется функционально активная рибосома 70S. Молекула инициаторной тРНК с метионином оказывается связанной с Р-участком рибосомы. Поэтому синтез полипептидной цепи может начинаться сразу же после присоединения к свободному А-участку рибосомы второй молекулы аа-тРНК, выбор которой определяется кодоном, расположенным в молекуле мРНК сразу же после инициаторного АУГ-кодона. Далее начинается стадия элонгации.

Элонгация

Элонгация представляет собой процесс удлинения растущей на рибосоме полипептидной цепи за счет включения в нее аминокислотных остатков в последовательности, соответствующей порядку расположения кодонов в мРНК.

После присоединения к формилметионину очередной аминоацил-тРНК растущая полипептидная цепь превращается в пептидил-тРНК.

Для осуществления элонгации, помимо уже сформировавшегося активного комплекса 70S-рибосома – мРНК – формилметионил-тРНК (пептидил-тРНК), необходимо участие белковых факторов элонгации (у прокариот – EF-Тu, EF-Ts, EF-G) иГТФ.

Элонгация протекает как многократно повторяющийся (по числу кодонов в мРНК) циклический процесс, складывающийся из трех отдельных этапов (рис. 26).

Первый этап – связывание молекулы аа-тРНК со свободным А-участком рибосомы. При этом Р-участок занят тРНК, несущей пептидил. Связывание происходит путем спаривания нуклеотидов антикодона аа-тРНК с кодоном мРНК, расположенным в А-участке.

Второй этап – образование очередной пептидной связи. Карбоксильный конец растущего пептидила отделяется в Р-участке от молекулы донорной тРНК (т. е. тРНК, несущей пептидил) и образует пептидную связь с аминокислотой, присоединенной к молекуле акцепторной тРНК (т. е. служащей акцептором для растущего пептидила) в А-участке (см. формулу на с. 69).

Третий этап – транслокация. Образовавшаяся новая пептидил-тРНК переносится из А-участка в Р-участок рибосомы, а сама рибосома продвигается вдоль мРНК ровно на один кодон (три нуклеотида). Это событие требует затраты энергии. Движущей силой транслокации служит ряд конформационных изменений, вызываемых в одном из белков рибосомы в результате гидролиза связанной с ним ГТФ. В момент транслокации происходит отделение освободившейся во время второго этапа от пептидила в Р-участке тРНК и возвращение ее в цитоплазму. По завершении третьего этапа рибосома возвращается в состояние, аналогичное исходному. Ее А-участок свободен и может принять новую молекулу аа-тРНК, отбираемую очередным кодоном мРНК, т. е. рибосома может снова повторить цикл элонгации.


Рис. 26. Схематическое изображение основных фаз элонгации, протекающей на рибосомах

Объяснение в тексте (по Б. Альбертсу [и др.])


Таким образом, каждый цикл работы рибосомы означает присоединение одной аминокислоты (трансляцию одного кодона). В ходе элонгации рибосома совершает последовательно столько циклов, сколько кодонов она транслирует, т. е. сколько аминокислот она включает в полипептидную цепь.

Терминация трансляции

Терминация трансляции – процесс завершения синтеза полипептидной цепи и освобождение ее из связи с последней донорной тРНК и с рибосомой. Функцию сигнала, означающего конец трансляции цистрона мРНК, выполняет один из 3 кодонов – УАА, УАГ и УГА. Эти триплеты не кодируют ни одной из 20 аминокислот («стоп-кодоны»). После завершения трансляции происходит отделение от рибосомы не только полипептидной цепи и тРНК, но и мРНК, и диссоциация 70S рибосомы на 50S и 30S субъединицы.

Помимо стоп-кодонов, в этих реакциях принимают участие различные белковые факторы освобождения, а также обе субъединицы рибосомы.

Вновь синтезированная полипептидная цепь отделяется от рибосомы, когда рибосома достигает одного из трех стоп-кодонов. Со стоп-кодоном, поступившим на А-участок, в этом случае связывается не антикодон аа-тРНК, а особый белок – фактор освобождения. В результате его присоединения происходит изменение активности расположенного по соседству фермента пептидилтрансферазы. Измененный фермент присоединяет к пептидил-тРНК не свободную аминогруппу аминокислоты, а молекулу H2O. Это приводит к гидролизу сложноэфирной связи между С-концевым карбоксилом пептидила и 3'-рибозы ЦЦА последней донорной тРНК. В результате гидролиза полипептид, удерживаемый на рибосоме только посредством его связи с молекулой тРНК, отделяется от рибосомы. Это влечет за собой отделение от рибосомы последней донорной тРНК, освобождение мРНК и диссоциацию 70S рибосомы на ее 30S и 50S субъединицы.

Модификация полипептидной цепи

Заключительным этапом биосинтеза белка является модификация полипептидной цепи, вслед за которой белковая молекула приобретает свою окончательную структуру и конформацию, определяющую ее функциональные свойства.

Реакция модификации чаще всего сводится либо к отделению только формильной группы метионина (у бактерий), и тогда N-концевой аминокислотой становится метионин; либо к отделению метионина (у животных) или формила и метионина (у бактерий), и тогда N-концевой становится аминокислота, располагающаяся вслед за метионином (формилметионином). В реакции модификации участвуют специальные ферментные системы – пептиддеформилаза (отделяет формильную группу от формилметионина), аминопептидаза (отщепляет метионин) или другие ферменты.

Реакции модификации осуществляются уже после освобождения полипептидной цепи из рибосомы.

В связи с тем что у бактерий хромосомы и плазмидные ДНК располагаются в цитоплазме и не отграничены от нее никакими мембранами, процессы транскрипции, трансляции и деградации мРНК протекают одновременно, т. е. трансляция мРНК может начинаться раньше, чем завершится транскрипция, а деградация мРНК начинается раньше, чем закончится ее полная трансляция.

Определение скорости биосинтеза белка у бактерий, проведенное с помощью различных методов, показало, что она соответствует включению рибосомой в полипептидную цепь в 1 с при температуре 37 °C 15 – 30 аминокислот.

Это означает, что рибосома продвигается вдоль мРНК со скоростью 45 – 90 нуклеотидов в 1 с. Следовательно, время для выбора каждой очередной аа-тРНК из среды и включения ее в полипептидную цепь, т. е. время полного рабочего цикла рибосомы, составляет около 0,03 – 0,06 с. За этот короткий срок на рибосоме осуществляется серия сложных и взаимообусловленных событий, обеспечивающих высокую точность процесса трансляции. Все это говорит о существовании специфических и надежных систем регуляции биосинтеза белка на уровне не только транскрипции, но и трансляции.

Синтез всех компонентов белоксинтезирующей системы, в том числе рибосом, контролируется соответствующими генами. Существенно, что у бактерий имеется по нескольку копий оперонов рибосомальных РНК, например, у E. coli их шесть. Это позволяет бактериям значительно изменять скорость биосинтеза рРНК, а следовательно и рибосом, в зависимости от условий среды. Поэтому содержание рибосом у них не является постоянным, а может варьировать, например, у E. coli от 10 тыс. до 100 тыс. и более на клетку. Чем богаче среда, тем больше в клетке синтезируется рибосом. Для бактерий характерна следующая фундаментальная закономерность: общая интенсивность биосинтетических процессов (а следовательно, и скорость роста) определяется суммарной скоростью биосинтеза белка, а она, в свою очередь, непосредственно зависит от содержания в клетке рибосом. Поэтому регуляция содержания рибосом является одним из важнейших механизмов, с помощью которых осуществляются адаптация бактерий к изменяющимся условиям среды и эволюционное сохранение видов бактерий в природе.

Таким образом, основными особенностями метаболизма бактерий являются: высокая интенсивность обмена веществ, разнообразие типов метаболизма, способность к саморегуляции активности биосинтетических процессов в зависимости от условий существования. Кроме того, гены бактерий, в отличие от генов вирусов и эукариот, не содержат интронов, поэтому у бактерий отсутствует процесс сплайсинга при синтезе мРНК.

Сплайсинг мРНК (англ. splice – сращивать) – сложный процесс, при котором происходит вырезание интронов (некодирующих последовательностей у генов, имеющих интрон-экзонную структуру) из первичных РНК-транскриптов и сшивание экзонов, в результате которого образуется и затем транслируется зрелая мРНК.

Размер интронов у эукариот варьирует приблизительно от 100 до 10 000 нуклеотидов. Основное отличие интронов от экзонов (кодирующих последовательностей) состоит в том, что большую часть нуклеотидов интрона можно искусственно изменить, не нарушая функции гена.

На каждом из концов интрона находятся короткие нуклеотидные последовательности (почти одинаковые у всех интронов), которые служат сигналами для сплайсинга РНК. Предполагается, что вырезание интронов и сращивание экзонов происходит с участием специфических последовательностей РНК, называемых донорными (5'-конец) и акцепторными (3'-конец) контактами (сайтами) сплайсинга. Процесс выщепления интрона должен происходить с большой точностью, так как ошибка, которая приведет к появлению хотя бы одного неправильного нуклеотида, вызовет изменение рамки считывания и, следовательно, структуры белка или прекращение трансляции из-за образования стоп-сигнала.

Сплайсинг в ядре протекает с участием особых малых ядерных рибонуклеопротеиновых частиц (мяРНП), или частиц U1. Эта частица содержит небольшую молекулу РНК длиной 165 нуклеотидов, в составе которой имеются последовательности, комплементарные нуклеотидным последовательностям пограничных экзон-интронных и интрон-экзонных сайтов молекулы первичного РНК-транскрипта. Благодаря комплементарному спариванию оснований РНК U1 и РНК-транскрипта происходят сближение донорного и акцепторного сайтов, затем их разрывы и воссоединение цепи в области донорного и акцепторного контактов, формирование единой молекулы зрелой РНК и выщепление интронных последовательностей.

Наличие аппарата сплайсинга наделяет эукариотные клетки дополнительной генетической гибкостью, связанной с тем, что сплайсинг одного и того же первичного транскрипта (особенно при наличии в гене нескольких интронов), осуществляемый разными способами, может привести к образованию нескольких молекул мРНК, кодирующих разные белки. Такая неоднозначность сплайсинга присуща и вирусам, например аденовирусам, ретровирусам, вирусу гепатита В и др. Геном аденовируса направляет синтез нескольких очень длинных РНК-транскриптов, каждый из которых содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие целый ряд различных белков. У вируса иммунодефицита человека 9 генов кодируют 15 вирусспецифических белков. Таким образом, благодаря механизму сплайсинга обеспечивается повышение информационной емкости генома без увеличения его размера. Это особенно важно для вирусов, у которых размер генома жестко ограничен величиной вириона.

Глава 7 Особенности энергетического обмена (катаболизма)

Сущность энергетического обмена заключается в обеспечении организма энергией, необходимой для проявления жизни. Как уже было отмечено выше, основным источником энергии служит солнечный свет, его энергию улавливают с помощью фотосинтеза растения и фотосинтезирующие бактерии, преобразуя ее в энергию химических структур – глюкозы и других органических соединений. В последующем энергия этих соединений мобилизуется с помощью реакций окисления-восстановления и консервируется в форме АТФ. Молекулы АТФ синтезируются в результате переноса электрона от его первичного донора до конечного акцептора. В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, различают аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором электронов служит молекулярный кислород (О2), а при анаэробном – различные неорганические соединения: NO3, SО42–, SO32–. Таким образом, энергия мобилизуется в реакциях окисления и восстановления. Окисление – отдача электронов, восстановление – присоединение электронов. Когда отнятие пары электронов или атомов водорода от органического субстрата сопряжено с восстановлением кислорода до воды, это сопровождается значительным изменением свободной энергии (?G0). Оно примерно равно изменению энергии при сжигании одной молекулы водорода (?G0 = – 57,04 ккал). Перенос электронов по цепи позволяет этой энергии выделяться порциями и превращать часть ее в богатые энергией связи АТФ. Чтобы такая цепь переноса действовала, в ней должен существовать градиент способности к окислению. Способность вещества отдавать электрон или присоединять его (т. е. окисляться или восстанавливаться) количественно выражается в виде его окислительно-восстановительного потенциала.

Переносчики электронов в цепи их переноса участвуют в последовательных реакциях с постепенно увеличивающимися значениями ?E'0 (?E'0 – разность между потенциалами двух полуреакций) и увеличением окислительно-восстановительного потенциала.

Принципиальная схема цепи переноса электронов от первичного донора электронов (атома водорода) до конечного его акцептора О2 выглядит так:



Окислительно-восстановительный потенциал указан в вольтах при стандартных условиях (25 °C, рН = 7,0, все реагенты в концентрации 1,0 М). Однако у бактерий встречаются самые разнообразные варианты этой общей схемы. В связи с этим они по типу дыхания подразделяются на следующие четыре группы:

1) строгие аэробы (размножаются только в присутствии кислорода);

2) микроаэрофилы (нуждаются в уменьшенной концентрации свободного кислорода);

3) факультативные анаэробы (могут потреблять глюкозу и размножаться как в аэробных, так и в анаэробных условиях);

4) строгие анаэробы (размножаются только в бескислородных условиях, т. е. не используют О2 в качестве конечного акцептора электронов).

Максимальная мобилизация энергии из глюкозы происходит при ее окислении через цикл лимонной кислоты (цикл Кребса). Один моль глюкозы С6Н12О6 содержит около 690 ккал (такое количество энергии выделяется при сжигании 180 г глюкозы). На первом этапе потребления глюкозы в отсутствие кислорода (при гликолизе) из одной ее молекулы образуются две молекулы молочной кислоты и синтезируются всего две молекулы АТФ. Каждая молекула АТФ имеет одну богатую энергией (10 ккал) пирофосфатную химическую связь. После расщепления глюкозы до молочной кислоты последняя в присутствии кислорода окисляется и превращается в пировиноградную кислоту, которая далее полностью окисляется через цикл Кребса до СО2 и Н2О. Каждая молекула лактата (пирувата) отдает 6 пар электронов. При переносе каждой пары электронов по цепи переноса часть их энергии используется для образования 3 молекул АТФ (рис. 27).

Таким образом, полное окисление одного моля глюкозы сопровождается синтезом 38 молекул АТФ с общим запасом энергии в 380 ккал, или около 55 % всей энергии моля глюкозы (690 ккал); остальная энергия подвергается диссипации, т. е. бесполезному рассеиванию в виде тепла. Однако и такой выход полезной энергии является достаточно высоким. Выход для многих бактерий известен, как и урожай клеток, который составляет около 10 г сухого вещества на 1 моль образовавшегося АТФ. Для объяснения механизма мобилизации энергии, т. е. синтеза АТФ при переносе электронов, предложен ряд гипотез, в том числе химио-осмотическая гипотеза Митчелла. Она исходит из того, что цепь переноса электронов, локализованная в мембране (у бактерий в ЦМ), ориентирована поперек нее, а электроны переносятся последовательно от одного носителя к другому в направлении возрастающего окислительно-восстановительного потенциала. Окисление переносчиков электронов сопровождается одновременным переносом протонов (Н+) с внутренней поверхности мембраны на ее внешнюю поверхность (рис. 28). Поскольку мембрана во всех других случаях непроницаема для протонов, возникает градиент концентрации протонов (рН+) между внутренним и внешним слоями мембраны, и она становится «энергизованной». Энергия градиента протонов используется клеткой для различных процессов, в том числе для активного транспорта питательных веществ, вращения жгутиков и синтеза АТФ. Протоны могут проникать обратно через мембрану лишь в определенных участках ее через особые каналы, с которыми связаны специфические ферменты АТФазы, катализирующие реакцию синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфора (Фн):



Перемещение протонов по их электрохимическому градиенту с помощью мембранной АТФ-азы служит источником энергии для образования АТФ. Реакция поддерживается градиентом протонов. Однако АТФаза может вызывать и гидролиз АТФ. Это также приведет к перемещению протонов из клетки и созданию их градиента, энергия которого может быть использована для процессов, требующих ее затраты. Некоторые энергообразующие реакции являются общими для аэробных и анаэробных механизмов дыхания. К ним относятся три пути превращения сахаров в основной энергетический метаболит – пировиноградную кислоту: путь Эмбдена – Мейергофа (гликолиз), пентозофосфатный путь (или гексозофосфатный шунт) и путь Энтнера – Дудорова, обнаруженный лишь у некоторых прокариот.

В первом случае (путь Эмбдена – Мейергофа, гликолиз, рис. 29) вначале затрачиваются две молекулы АТФ на образование фруктозо-1,6-дифосфата, который затем расщепляется на фосфоглицериновый альдегид и диоксиацетонофосфат. В результате окисления последних, сопряженного с восстановлением НАД, из каждой образуется по молекуле 1,3-дифосфоглицериновой кислоты. На последующих этапах превращения ее в пировиноградную кислоту происходит так называемое субстратное фосфорилирование, т. е. обе фосфатные группы переносятся на АТФ и, таким образом, на каждую молекулу глюкозы образуются 4 молекулы АТФ. Поскольку две из них затрачиваются на начальных этапах превращения глюкозы, общий выход энергии составляет 2 молекулы АТФ на моль глюкозы.



скачать книгу бесплатно

страницы: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24