скачать книгу бесплатно
и может денатурироваться и ренатурироваться без потери инвазивной способности. При анализе первичной структуры PrP
выявлена его 80 %-ная гомология у разных видов животных. При этом около 42 % нормальной изоформы PrP
составляют альфа-спирали при почти полном отсутствии бетаскладчатых структур (тяжей), в то время как для патологического PrP
характерны бета-тяжи (43 %) при уменьшении количества альфа-спиралей (30 %). При обработке реагентами, уменьшающими образование бета-тяжей, снижается инфекционность прионов и их устойчивость к действию протеазы К. Таким образом, в основе прионных заболеваний лежит посттрансляционное изменение конформации нормального клеточного белка с разрушением альфа-спиралей и образованием бета-структур.
В настоящее время различают не менее четырех типов прионных белков. Доказано, что с первым и вторым типами PrP
связаны фамильные, спорадические и ятрогенные формы болезни Крейтцфельдта – Якоба. Четвертый тип, возможно, является возбудителем новой атипичной формы этой болезни и больных животных («бешенство» коров).
Возможна как наследственная передача по аутосомно-доминантному типу наследования, так и заражение алиментарным или парентеральным (ятрогенным) путем, причем при повторном инфицировании существует риск кумулятивного эффекта. Ятрогенный путь заражения может быть связан с использованием инфицированных электродов, хирургических, стоматологических и других инструментов, а также ряда лекарственных препаратов. При этом остается неясным вопрос безопасности использования препаратов, изготовленных из мозга и лимфоидной ткани крупного рогатого скота, – миелопептидов, стимуляторов, церебролизина, холестерина и т. д.
Алиментарный путь заражения связан с употреблением продуктов, инфицированных прионами. Этому способствует устойчивость прионов к протеазам пищеварительных соков. Широко известная эпидемия бешенства коров, затронувшая половину коровьих стад в Великобритании, была вызвана костной мукой, добавлявшейся в корм животным. Костная мука изготовлялась из мяса и костей погибших овец, большинство из которых страдали болезнью скрепи. После изменения технологии обработки костной муки (прекращения экстрагирования жиров и снижения температуры ее стерилизации) в начале 1980-х годов было зарегистрировано два случая «бешенства» коров. Далее эпизоотия развивалась крайне интенсивно, достигнув пика к 1992 г. В 1990 г. описан первый случай губчатой энцефалопатии у кошки в Великобритании, вскоре поступили сообщения о подобных заболеваниях у пумы, гепарда, тигра и других представителей семейства кошачьих, а также у диких экзотических копытных в лондонском зоопарке. Временно?е и географическое распространение губчатой энцефалопатии кошек дало основание полагать, что ее источником является корм, полученный из мяса крупного рогатого скота, а заражение копытных обусловлено использованием костной муки. В 1996 г. представлены доказательства – идентичность штаммов инфекционного прионного белка – в пользу связи потребления мяса зараженных животных и так называемого «нового варианта» болезни Крейтцфельдта – Якоба (БКЯ), отличающегося более коротким инкубационным периодом (2 – 5 лет), молодым возрастом заболевших (до 40 лет) и клиническими проявлениями, аналогичными таковым при болезни куру.
Таблица 3
Инфекционность тканей, биологических жидкостей и экскретов больных (по данным ВОЗ)
Остается проблемой также использование субпродуктов в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности, например желатина, который изготавливается из кожи и костей, но может содержать небольшое количество костного мозга, инфицированного прионами, а также кремов и других косметических и фармацевтических препаратов, содержащих коллаген, полученный из тканей коров и т. д. (табл. 3). Необходимо отметить, что ткани остаются заразными даже после их фиксации формалином. Существует видовой барьер к прионным инфекциям у различных видов животных, что может быть связано с различными структурами генов, кодирующих PrP. В большинстве случаев эти барьеры не абсолютны, они не препятствуют, а только затрудняют передачу инфекции от особей одного вида особям другого вида. На межвидовой перенос влияют два фактора: во-первых, эффект вида донора, связанный с различиями в последовательностях гена PrP у двух видов донор – реципиент, и, во-вторых, штаммовые особенности приона, определяющие степень сложности преодоления межвидового барьера.
Первоначально после заражения прионы появляются в лимфоидной ткани – лимфатических узлах, селезенке, тимусе, особенно в В-клеточных зонах. О важной роли В-лимфоцитов в патогенезе прионных инфекций говорит устойчивость мышей к скрепи с дефицитом этих клеток. В лимфоидной ткани происходит частичная репликация прионов, затем они по нервам достигают ближайших аксонов. После размножения в аксонах прионы продвигаются к спинному, затем к головному мозгу со скоростью около 1 мм в день, где их репликация может происходить как в нейронах, так и в глиальных клетках. Внутриклеточное накопление PrP
в головном мозге проявляется вакуолизацией и дегенерацией нейронов, их гибелью и реактивным астроцитозом. Внеклеточные скопления PrP
выявляются как амилоидные бляшки. Максимум инфекционности достигается задолго до клинических проявлений заболевания, с чем связаны трудности ранней диагностики и опасность передачи инфекции с продуктами питания.
Заболевания, вызываемые прионами, характеризуются длительным инкубационным периодом (до 40 лет), отсутствием воспалительных изменений, прогрессированием симптомов без ремиссий и выздоровления, отсутствием продукции интерферона и чувствительности к нему, интактностью Т- и В-клеток, устойчивостью к иммуноподавляющему или иммуностимулирующему действию гормонов и других препаратов.
Все прионные инфекции характеризуются прогрессирующей дегенерацией ЦНС с преимущественным поражением серого вещества, выявляется также вторичная потеря миелина и поражение белого вещества. Макроскопически выявляется снижение объема мозга и уменьшение толщины его коры, гистологически – вакуолизация нейронов и предельное уменьшение их количества, что сопровождается пролиферацией и гипертрофией астроцитов. Для прионных инфекций характерны также спонгиоформные изменения с образованием вакуолей от 5 до 100 мкм в диаметре между телами нервных клеток. В мозговой ткани накапливается патологический белок с массой 27 – 30 кД, состоящий из 55 аминокислот, который является дериватом большого белка-предшественника PrP
после его расщепления протеазой К.
Таблица 4
Прионные заболевания человека и животных
Прионные заболевания всегда смертельны, гибель наступает от истощения или от пневмонии. Их типичными клиническими проявлениями являются:
– расстройства чувствительной сферы – амнезия различной степени, потеря и извращение чувствительности, выпадение функций органов чувств;
– нарушения двигательной сферы – атаксия, обездвиживание, атрофия мышц, в том числе дыхательных, параличи;
– нарушения психики – утрата профессиональных навыков, депрессия, сонливость, агрессивность, снижение интеллекта до полной деменции.
К прионным болезням человека в настоящее время относят пять заболеваний (табл. 4), которые обусловлены различными мутациями одного PRNP гена человека: болезнь Крейтцфельдта – Якоба (БКЯ); синдром Герстмана – Штраусслера – Шейнкера (СГШШ); синдром фатальной бессонницы; болезнь куру; хроническая прогрессирующая энцефалопатия детского возраста (синдром Альперса).
В настоящее время не существует эффективной этиотропной и патогенетической терапии прионных болезней. На ранних стадиях используется симптоматическая терапия для коррекции расстройств сна, поведенческих нарушений, миоклонии; на поздних – поддерживающая терапия.
Перспективным направлением в лечении прионных заболеваний можно считать создание препаратов, направленных на стабилизацию альфа-структур PrP, снижение их количества и предотвращение конформационных изменений. В эксперименте амфотерицин, некоторые ингибиторы синтеза вирусного гликопротеида и кортикостероиды увеличивают инкубационный период, а некоторые антибиотики несколько удлиняют продолжительность жизни животных, зараженных скрепи. Брефелдин А разрушает аппарат Гольджи и препятствует синтезу PrP
в инфицированной культуре клеток.
Профилактика прионных заболеваний включает:
• использование генно-инженерных гормональных препаратов;
• ограничение трансплантации тканей;
•соблюдение при работе с биологическими жидкостями и тканями правил, предусмотренных для работы с больными СПИДом;
• уничтожение хирургических инструментов, используемых у больных БКЯ либо обработка их гипохлоритом с последующей очисткой и автоклавированием при температуре 134 °C в течение 1 часа;
• запрет на использование пищи, подозрительной на содержание инфекционного прионного белка;
• разведение пород домашних животных, резистентных к прионам;
• выявление носителей патогенных мутаций и т. п.
Прижизненная диагностика прионных заболеваний затруднена. Для установления точного диагноза прионного заболевания человека требуется, чтобы был выявлен один из четырех дополнительных критериев:
• наличие PrP амилоидных бляшек;
• способность ткани к заражению спонгиоформной энцефалопатией животных;
• наличие изоформ прион-протеина PrP
;
• наличие патогенного мутированного гена PRNP.
На ранних этапах заболевания большое значение в диагностике прионных болезней имеет электроэнцефалографическое исследование, при котором можно выявить замедление биоэлектрической активности. Комьютерная томография позволяет определить прогрессирующую атрофию головного мозга.
Для выявления прионного белка PrP
в биоптате мозговой ткани и глоточной миндалины используются методы иммуноцитохимического анализа, гисто- и иммуноблоттинга.
Для определения инфекционности тканей проводится внутримозговое заражение лабораторных животных. Исследование может проводиться только в специализированных лабораториях и зависит от ряда факторов, например от видового барьера. В. А. Зуевым предложено использование перевиваемых культур клеток невриномы узла тройничного нерва крыс для культивирования прионов и прижизненной диагностики прионных заболеваний, а также выявления антител к нейрофиламентам.
Глава 3
ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
3.1. Метаболизм
Метаболизм представляет собой совокупность двух противоположных, но взаимосвязанных процессов: энергетического метаболизма (катаболизма) и пластического (конструктивного) метаболизма (анаболизма).
Прокариоты, как и эукариоты, в процессе ферментативных катаболических реакций выделяют энергию, которая аккумулируется в молекулах АТФ. В процессе ферментативных анаболических реакций эта энергия расходуется на синтез многочисленных макромолекул органических соединений, из которых в конечном итоге строятся биополимеры – составные части микробной клетки. Взаимосвязь анаболизма и катаболизма выражается также в том, что на определенных этапах метаболизма образуются одинаковые промежуточные продукты (амфиболиты), которые используются в обоих процессах.
Метаболизм микроорганизмов характеризуется ярко выраженным разнообразием. В качестве питательных веществ микробные клетки используют различные органические и минеральные соединения.
3.2. Источники углерода и типы биологического окисления
В соответствии с законом сохранения энергии все функции живого организма, требующие затраты энергии, должны осуществляться за счет внешних источников энергии, которые бывают двоякого рода.
Автотрофные организмы могут синтезировать органические соединения из неорганических веществ (прежде всего из СО
иН
О), используя дополнительные источники энергии. Гетеротрофные организмы используют в качестве источника энергии готовые органические «питательные вещества» и живут за счет автотрофных организмов и их биосинтетических процессов.
При распаде органических веществ химически связанная энергия освобождается (катаболизм, диссимиляция). Этот распад без участия кислорода (анаэробные условия) приводит к образованию органических продуктов, богатых энергией, таких, как органические кислоты или этанол (брожение), а при использовании кислорода (аэробные условия) – конечных продуктов: углекислого газа и воды (дыхание), бедных энергией.
Суммарные уравнения дыхания складываются из двух процессов:
1) постепенного расщепления субстрата с отнятием водорода, который связывается с коферментами;
2) постепенного окисления водорода в результате переноса его на кислород.
Расщепление углеводов происходит в результате последовательного воздействия на субстрат различных ферментов. Этот процесс начинается с гликолиза. При подготовке к расщеплению различные углеводы превращаются в фруктозо-1,6-фосфат. Гликолиз – это процесс окислительного расщепления, происходящий в цитоплазме бактерий и ведущий от фруктозо-1,6-фосфата к промежуточному продукту – пировиноградной кислоте.
При разных видах брожения дальнейшая судьба продуктов гликолиза – пировиноградной кислоты и NAD ? Н – различна.
При молочнокислом брожении (стрептококки, лактобациллы) водород переносится на пировиноградную кислоту и образуется молочная кислота:
При спиртовом брожении (сахаромицеты) пировиноградная кислота сначала декарбоксилируется, т. е. от нее отщепляется СО
,азатем промежуточный продукт (ацетальдегид) восстанавливается в этиловый спирт (этанол) в результате переноса водорода:
При маслянокислом брожении (клостридии) пировиноградная кислота превращается в ацетат [C H
?C=0], связанный с коферментом (ацетил-СоА). Два таких остатка соединяются в ацетоацетат, который восстанавливается до н-масляной кислоты (СН
СН
СН
СООН).
В 30-е годы XX века В. А. Энгельгардом, О. Варбургом, Ф. Лимпаном и Д. Диккенсаном было доказано, что кроме гликолиза в бактериальных клетках существует еще один путь расщепления углеводов – ступенчатый окислительный распад гексоз до пентоз и других сахаров с более короткой цепью. Ключевую роль в таких реакциях играют пентозофосфаты, в связи с чем этот цикл называется пентозофосфатным.
Суммарное уравнение этого цикла имеет вид:
Небольшое число микроорганизмов, к которым относятся главным образом бактерии из рода Pseudomonas, получают энергию с помощью специфического метаболического пути – Энтнера – Дудорова. Существует предположение, что он появился в связи с высокой потребностью прокариот в пировиноградной кислоте как кратчайшему пути ее образования (всего 4 реакции, тогда как при гликолизе она образуется после 9 реакций).
В аэробных условиях пировиноградная кислота (ПВК) подвергается окислительному декарбоксилированию в цикле трикарбоновых кислот до конечных продуктов: СО
иН
О. Непосредственным реакциям цикла предшествует подготовительная фаза – окисление пировиноградной кислоты до ацетилкоэнзима А (ацетил = СоА):
Окислительное декарбоксилирование ПВК катализируется пируватдегидрогеназной системой. Она состоит не менее чем из трех ферментов, которые используют пять коферментов: тиамидинфосфат, амид липоевой кислоты, коэнзим А, FAD, NAD.
При аэробном окислении 1 моля глюкозы клетка получает 38 молей АТФ, тогда как при гликолизе только два.
В цикле трикарбоновых кислот от субстратов отделяются протоны и электроны. Они поступают на коферменты NAD
и FAD
, которые передают их в дыхательную цепь, образованную окислительно-восстановительными ферментами, находящимися на плазматической мембране у прокариот и на внутренней мембране митохондрий у эукариот. Передвигаясь от одного переносчика электронов к другому, электроны опускаются на все более низкие энергетические уровни, отдавая порциями свою энергию. В последнем звене цепи они восстанавливают молекулярный кислород. Освобожденная при переносе электронов по дыхательной цепи энергия запасается в фосфатных связях АТФ. Окислительно-восстановительные ферменты представлены дегидрогеназами, флавопротеидами, цитохромами, а также убихиноном и белками, содержащими железо и серу.
Автотрофный метаболизм осуществляется бактериями путем фотосинтеза и хемосинтеза. Для облигатных автотрофов фотосинтез – единственный источник энергии: у них нет процессов диссимиляции, поставляющих АТФ. Фотосинтез состоит из двух фаз: световой и темновой. Световой процесс можно представить так:
Во время темновой фазы атомы водорода, поставляемые световыми реакциями, используются для восстановления СО
до углеводов согласно общему уравнению фотосинтеза:
При этом на каждый моль синтезированного углевода запасается около 160 кДж энергии.
Русским микробиологом С. Н. Виноградским было показано, что хемосинтезирующие бактерии получают энергию при окислении неорганических соединений:
Хемосинтез (в отличие от фотосинтеза) – облигатно аэробный процесс.
При аэробном (кислородном) дыхании конечным акцептором электронов служит кислород, а при анаэробном (бескислородном) – неорганические соединения. Исходя из этого, по типу дыхания выделяют следующие группы бактерий:
– строгие (облигатные) аэробы, которые размножаются только в присутствии кислорода, например псевдомонады;
– микроаэрофилы, которым требуется меньшее количество кислорода, например кампилобактеры;
– факультативные анаэробы, которые могут размножаться как в аэробных, так и в анаэробных условиях, например энтеробактерии;
– строгие (облигатные) анаэробы, которые размножаются только в бескислородных условиях, например бактероиды.
Отдельно следует выделить аэротолерантные бактерии, которые способны расти в присутствии кислорода, но они не используют этот кислород в качестве источника энергии, а получают энергию при брожении, например молочнокислые бактерии.
Токсическое действие кислорода на бактерии объясняется отсутствием у них ферментов каталаз и системы регуляции окислительно-восстановительного потенциала.
3.3. Источники азота
Для синтеза азотсодержащих соединений (аминокислот, пуринов, пиримидинов, некоторых витаминов) микроорганизмы нуждаются в доступном источнике азота. Одни из них способны усваивать молекулярный азот из атмосферы (азотфиксирующие бактерии), другие ассимилируют только азотсодержащие органические соединения.
Микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения из глюкозы и солей аммония, называют прототрофами. В отличие от них микроорганизмы, не способные синтезировать какое-либо из жизненно необходимых соединений, называют ауксотрофами. Они ассимилируют эти и другие соединения в готовом виде из окружающей среды или организма хозяина. Ауксотрофами чаще всего являются патогенные или условно-патогенные для человека микроорганизмы.
Кроме азота и углерода всем микроорганизмам для биосинтетических реакций необходимы соединения, содержащие фосфор, серу, а также ионы магния, калия, кальция, железа и другие микроэлементы.
Потребность того или иного микроорганизма в определенных факторах роста является стабильным признаком, который используется для дифференциации и идентификации бактерий, а также при изготовлении питательных сред для лабораторных и биотехнологических целей.
Многие микроорганизмы, особенно бактерии, нуждаются в тех или иных аминокислотах (одной или нескольких), поскольку не могут их самостоятельно синтезировать: клостридии нуждаются в лейцине, тирозине; стрептококки – в лейцине, аргинине и др. Такого рода микроорганизмы называются ауксотрофными по тем или иным аминокислотам, которые они не способны синтезировать.
