Биохимия метаболизма. Учебное пособие

скачать книгу бесплатно

Рисунок 2. Схема перехода двух форм фосфорилазы.

Фосфорилаза b вновь превращается в активную фосфорилазу а под действием фермента, называемого киназой фосфорилазы b; он катализирует реакцию, в ходе которой АТФ фосфорилирует остатки серина в активном центре молекулы фосфорилазы b, что и приводит к образованию фосфорилазы а. Таким образом, благодаря действию двух ферментов, фосфатазы фосфорилазы а и киназы фосфорилазы b, соотношение активной фосфорилазы а и сравнительно мало активной фосфорилазы b в клетке может изменяться. В мышцах действует второй механизм регуляции гликогенфосфорилазной активности. Фосфорилаза b, сравнительно мало активная форма, может становиться более активной в результате нековалентного связывания с аллостерическим модулятором этого фермента, которым является AMФ; концентрация же AMФ в мышцах возрастает по мере распада АТФ в сократительных системах. Активации фосфорилазы b под действием AMФ препятствует АТФ, выступающий в роли отрицательного модулятора. Таким образом, активность фосфорилазы b определяется соотношением AMФ и ATФ. В отличие от фосфорилазы b фосфорилаза а не активируется AMФ; поэтому фосфорилазу а называют иногда AMФ-независимой формой, а фосфорилазу b AMФ-зависимой.

Таким образом, есть два механизма регуляции, которым подчиняется гликогенфосфорилаза скелетной мышцы: 1) ковалентная модификация посредством фосфорилирования или дефосфорилирования остатков серина в активном центре фермента и 2) аллостерическая регуляция фосфорилазы b путем нековалентного связывания с AMФ или АТФ. В покоящейся мышце почти вся фосфорилаза находится в неактивной, или b -форме, поскольку в такой мышце концентрация АТФ. В печени гликогенфосфорилаза также присутствует в а- и b-форме; в принципе ферменты печени функционируют подобно мышечным, от которых они, впрочем, несколько отличаются по своей структуре и регуляторным свойствам. Расщепление гликогена в печени имеет иное назначение, нежели в мышцах; этот процесс служит источником свободной глюкозы крови. Под действием фосфорилазы печени образуется глюкозо-1-фосфат, который затем превращается в глюкозо-6-фосфат, являющийся уже непосредственным предшественником свободной глюкозы. Реакция, в ходе которой образуется D-глюкоза крови, катализируется ферментом глюкозо-6-фосфатазой.

Второй этап регуляции гликолиза – регуляция реакции образования фруктозо-1,6-дифосфата, катализируемой фосфофруктокиназой. Фосфофруктокиназа (ФФК) – это сложный аллостерически регулируемый фермент, управляемый многими аллостерическими положительными и отрицательными модуляторами. В скелетных мышцах активность фосфофруктокиназы определяется концентрациями субстратов этого фермента (АТФ и фруктозо-6-фосфата) и его продуктов (AДФ и фруктозо-1,6-дифосфата); все эти соединения играют роль аллостерических регуляторов. Очень важны также в качестве регуляторов AMФ, цитрат, ионы Mg

, фосфат и некоторые другие метаболиты, присутствующие в мышечной ткани. Однако, хотя регуляции ФФК зависит от сложного взаимодействия ряда факторов, главными отрицательными модуляторами этого фермента являются АТФ и цитрат, а самыми активными положительными модуляторами AMФ и фруктозо-1,6-дифосфат. Всякий раз, когда при очень активном мышечном сокращении концентрация АТФ падает, а энергии требуется больше, фосфофруктокиназная активность усиливается, даже если концентрация фруктозо-6-фосфата очень низка. Если, однако, уровень АТФ в клетке уже высок по сравнению с уровнем AДФ и AMФ, то кажущееся сродство фосфофруктокиназы к фруктозо-6-фосфату сильно. В этом случае фосфофруктокиназа будет катализировать реакцию лишь при сравнительно высокой концентрации фруктозо-6-фосфата Цитрат, один из промежуточных продуктов цикла лимонной кислоты, усиливает ингибирование фосфофруктокиназы высокими концентрациями АТФ. В то же время повышение концентрации AMФ, образующегося в результате аденилаткиназной реакции в сокращающейся мышце, служит очень мощным стимулирующим модулятором и противодействует ингибирующему влиянию АТФ на фосфофруктокиназную реакцию.

В результате всех этих сложных аллостерических взаимодействий скорость реакции, катализируемой фосфофруктокиназой, возрастает иногда в сотни раз при переходе скелетной мышцы из состояния покоя к состоянию максимальной активности.

Третьим регулируемым этапом гликолиза является пируваткиназная реакция. Пируваткиназа также принадлежит к числу аллостерических ферментов. Этот фермент встречается, по меньшей мере, в трех изоформах, которые отличаются друг от друга по распределению в тканях и по реакции на различные модуляторы. При высоких концентрациях АТФ кажущееся сродство пируваткиназы к фосфоенолпирувату сравнительно невелико и соответственно невелика скорость пируваткиназной реакции при обычных концентрациях фосфоенолпирувата. Пируваткиназу ингибируют также ацетил-СоА и высокомолекулярные жирные кислоты – соединения, играющие важную роль в качестве топлива для цикла лимонной кислоты. Таким образом, когда в клетке уже велика концентрация АТФ или когда в ней уже достаточно топлива для процесса дыхания, обеспечивающего клетку энергией, гликолиз ингибируется за счет либо фосфофруктокиназы, либо пируваткиназы (в зависимости от условий). В то же время при низких концентрациях АТФ кажущееся сродство пируваткиназы к фосфоенолпирувату возрастает, и это позволяет ферменту переносить фосфатные группы от фосфоенолпирувата на AДФ даже при относительно низкой концентрации фосфоенолпирувата. Некоторые аминокислоты также действуют как модуляторы пируваткиназной активности, главным образом в печени. Во всех клетках гликолиз регулируется с очень высокой эффективностью, напоминающей действие компьютера, а потому изменения концентрации различных метаболитов могут влиять на его общую скорость.

Гликолиз – процесс анаэробного окисления моносахаридов, в результате которого происходит синтез АТФ. У аэробных организмов АТФ синтезируется еще и в процессах клеточного дыхания, в которых утилизируются другие продукты гликолиза (пируват и NADH), поэтому направление реакций гликолиза сдвинуто в сторону образования продуктов метаболитического пути.

У анаэробных организмов гликолиз один из основных путей энергетического обмена углеводов, но утилизации остальных продуктов не происходит, накопление этих продуктов может привести к остановке гликолиза, а следовательно и остановке энергетического обмена (АТФ не образуется), поэтому необходимо утилизировать пируват и NADH. Для этого появилась «надстройка» – брожение, для окисления NADH и сдвига реакций в сторону образования пирувата.

Брожение

У аэробных организмов пируват и NADH, образовавшиеся в ходе гликолиза, утилизируются в ходе клеточного дыхания. У анаэробных организмов этого не происходит, поэтому необходима надстройка. Этой надстройкой является процесс брожения.

Брожение – это тип анаэробного окисления пирувата.

В настощее время описано множество путей брожения. Все они выявлены у прокариотических организмов. Но два типа бружения встречаются не только у прокариот, но и у эукариот. У эукариотических организмов обнаружены гомоферментативное молочнокислое и спиртовое брожение.

Гомоферментативное молочнокислое брожение

Гомоферментативное молочнокислое брожение получило свое название (схема представлена на рисунке 3), из-за того, что происходит одна реакция осуществляемая ферментом лактат дегидрогеназой молекула пирувата восстанавливается до лактата и донором протонов и электронов является NADH.

Рисунок 3: Схема реакций гомоферментативного молочнокислого и спиртового видов брожения

Данный тип брожения характерен для многих бактерий. Многие возбудители заболеваний, например, стафилококки и стрептококки, осуществляют этот тип брожения. Но данный брожения встречается и у полезных бактерий. Молочнокислые бактерии используются при изготовлении молочнокислых продуктов, сыров, сырокопченых колбас, при квашении капусты, засолке огурцов, силосовании при заготовке кормов. Также молочнокислое брожение встречается и у эукариот. Паразиты крови (простейшие, паразитирующие в крови млекопитающих (возбудители малярии, сонной болезни), также используют данный тип утилизации пирувата.

Лактатдегидрогеназа присутствует и в тканях млекопитающих. Хотя в обычных условиях наши мышцы получают вполне достаточные количества кислорода, чтобы произошло окисление пирувата и образование АТФ аэробным путем, бывают обстоятельства, когда поступление кислорода оказывается недостаточным. Например, при крайнем напряжении сил, когда уже весь запас кислорода израсходован, мышечные клетки образуют лактат путем брожения. Более того, в белых мышцах рыб или домашней птицы аэробный метаболизм относительно невелик, и основным конечным продуктом оказывается L-лактат. В организме человека есть такие ткани, которые слабо снабжаются кровью, например, хрусталик и роговица глаза. В клетках этих тканей окислительный метаболизм выражен слабо, а энергия в основном образуется при сбраживании глюкозы в лактат. Часть лактата, образующегося в мышцах и других тканях, поступает в кровь и переносится в печень, где он снова окисляется в пируват. Меньшая часть пирувата затем окисляется в цикле трикарбоновых кислот, но большая его часть снова превращается в глюкозу. Последняя может опять поступать в кровь и возвращаться в мышцы. Весь этот процесс называется циклом Кори.

Спиртовое брожение

У дрожжей и у других микроорганизмов, сбраживающих глюкозу не до лактата, а до этанола и СО

, путь ферментативного расщепления глюкозы совпадает с описанным выше для анаэробного гликолиза на всем протяжении, за исключением этапа, катализируемого лактатдегидрогеназой (схема представлена на рисунке 3). В дрожжевых клетках, которые не содержат фермента, аналогичного лактатдегидрогеназе мышечной ткани, этот этап заменен двумя другими реакциями. В первой из них продукт расщепления глюкозы пируват теряет свою карбоксильную группу под действием пируватдекарбоксилазы. Эта реакция представляет собой простое декарбоксилирование; реального окисления пирувата при этом не происходит. Для проявления каталитической активности пируватдекарбоксилазе требуется Mg

. С молекулой этого фермента прочно связан кофермент тиаминпирофосфат. На последнем этапе спиртового брожения ацетальдегид восстанавливается до этанола за счет NADH, образовавшегося при окислении глицеральдегид-3-фосфата; эта реакция катализируется алкогольдегидрогеназой.

Таким образом, конечными продуктами спиртового брожения являются этанол и СО

, а не лактат. Пируватдекарбоксилаза содержится в клетках пивных дрожжей и других микроорганизмов, осуществляющих спиртовое брожение. В животных тканях этот фермент отсутствует. Лишены пируватдекарбоксилазы также организмы, осуществляющие молочнокислое брожение, например молочнокислые бактерии. Биохимия спиртового брожения лишь недавно изучена настолько хорошо, чтобы можно было представить этот процесс в виде ряда последовательных ферментативных реакций.

Что же касается виноделия и пивоварения, то это весьма древние искусства, освоенные людьми за сотни лет до того, как родилась сама наука химия. Более того, сами старинные рецепты приготовления пива и вина сыграли в свое время важную роль, послужив ключом к некоторым фундаментальным открытиям на заре развития биологии и биохимии.

Так, в 1856 г. Луи Пастер впервые убедительно показал, что сбраживание сахара в спирт вызывается микроорганизмами, а не какими-то магическими влияниями. Французские виноделы пригласили Пастера для того, чтобы он помог им выяснить, почему в иные годы вино не удается и превращается в уксус. Пастер в своих экспериментах, ставших классическими, показал, что в стерильных растворах глюкозы брожения не происходит, тогда как в растворах, соприкасающихся с нефильтрованным воздухом, брожение идет, и причина этого заключается в том, что в раствор попадают из воздуха споры дрожжей и других микроорганизмов.

Из налета на гроздьях свежесрезанного винограда Пастер выделил культуры дрожжей и доказал, что именно дрожжи ответственны за брожение, происходящее в соке, отжатом из раздавленного винограда. Он выяснил также, что превращение спирта в уксусную кислоту вызывается другими видами микроорганизмов – уксуснокислыми бактериями; эти аэробные организмы окисляют этанол с образованием уксусной кислоты.

Моносахариды вообще и глюкоза в частности используются не только для генерирования энергии в ходе гликолиза, но и в других метаболических путях, причем как в катаболических так и анаболических. К таким цепям реакций относятся: пентозофосфатный путь и окисление глюкозы до аскорбиновой кислоты.

Пентозофосфатный путь

Пентозофосфатный путь является альтернативным путем окисления глюкозы. Он включает несколько этапов, в результате функционирования которых из трех молекул глюкоза-6-фосфата образуются три молекулы СО

и три молекулы пентоз. Последние используются для регенерации двух молекул глюкозо-6-фосфата и одной молекулы глицеральдегид-3-фосфата. Поскольку из двух молекул глицеральдегид-3-фосфата можно регенерировать молекулу глюкоза-б-фосфата, глюкоза может быть полностью окислена при превращении по пентозофосфатному пути.

У растений часть реакций пентозофосфатного пути участвует также в образовании гексоз из СО

при фотосинтезе. Пентозофосфатный путь называют иногда пентозным шунтом, гексозомонофосфатным путем или фосфоглюконатным окислительным путем. Открытие Отто Варбургом (Otto Warburg) в 1931 г. глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, первого фермента этого пути, сделало возможной его полную расшифровку, которую осуществили Фриц Липман, Фрэнк Дикенс, Бернард Хорекер и Эфроим Рэкер.

Пентозофосфатный цикл не приводит к синтезу АТР, он выполняет две главные функции: 1) образование NADPH для восстановительных синтезов, таких, как синтез жирных кислот и стероидов; 2) обеспечение рибозой синтеза нуклеотидов и нуклеиновых кислот. Ферменты пентозофосфатного пути локализованы во внемитохондриальном пространстве клеткив цитозоле. Как и в процессе гликолиза, окисление осуществляется путем дегидрогенирования, однако акцептором водорода в этом случае служит не NAD, а NADP.

Рисунок 4: Схема реакций пентозофосфатного шунта (черный круг с буквой Р в центре обозначает фосфатную группу).

Последовательность реакций пути можно разделить на две фазы: окислительную и неокислительную (схема реакций представлена на рисунке 4). В реакциях первой фазы глюкоза-6-фосфат дегидрогенируется и декарбоксилируется с образованием рибулозо-5-фосфата. В ходе второй фазы рибулозо-5-фосфат превращается снова в глюкозо-6-фосфат в результате серии реакций, в которых главную роль играют два фермента: транскетолаза и трансальдолаза

Окислительная фаза пентозофосфатного пути начинается с дегидрирования глюкозо-6-фосфата при С-1, реакции, катализируемой глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназой.

Фермент высокоспецифичен в отношении NADP

; Км для NAD

примерно в тысячу раз выше, чем для NADP

. Продуктом реакции является 6-фосфоглюконо-?-лактон, внутримолекулярный эфир, с эфирной связью между С-1-карбоксильной группой и гидроксилом при С-5. Следующий этап – гидролиз 6-фосфоглюконо- ? -лактона специфической лактоназой, дающий 6-фосфо-глюконат. Этот шестиуглеродный сахар подвергается затем окислительному декарбоксилированию 6-фосфоглюконат – дегидрогеназой с образованием рибулозо-5-фосфата. Акцептором электронов вновь служит NADP

. (смотри рисунок). Конечным этапом синтеза рибозо-5-фосфата является изомеризация рибулозо-5-фосфата фосфопентозо-изомеразой. Эта реакция подобна гликолитическим реакциям:

Глюкозо-6-фосфат ? Фруктозо-6-фосфат

Дигидроксиацетонфосфат ? Глицеральдегид-3-фосфат.

Все три кетозо-альдозные изомеризации идут через образование ендиольного промежуточного продукта.

Окислительная фаза пентозофосфатного пути иногда считается основной и неокислительная рассматривается как связка с гликолизом. Это связано с тем фактом, что эти фазы могут идти как независимо друг от друга, так вместе. В ходе неокислительной фазы пентозофосфатного пути происходит регенерация рибозо-5-фосфата в глюкозо-6-фосфат. Основную роль в этом процессе играют два фермента: транскетолаза и трансалъдолаза. Эти же ферменты создают обратимую связь между пентозофосфатным путем и гликолизом, катализируя следующие три реакции:

Транскетолаза переносит двухуглеродную группу, включающую 1-й и 2-й атомы углерода кетозы, на альдегидный углерод альдозного сахара. Происходит, следовательно, превращение кетосахара в альдозу, содержащую на два атома углерода меньше, и одновременное превращение альдосахара в кетозу, содержащую на два атома углерода больше. Коферментом реакции является тиаминидифосфат (в его состав входит тиамин – витамин группы В), для ее протекания необходимы ионы Mg

. Переносимая двухуглеродная группа является, вероятно, гликоальдегидом, связанным с тиаминдифосфатом, т. е. «активным гликольальдегидом». Транскетолаза катализирует перенос двухуглеродной группы с ксилулозо-5-фосфата на рибозо-5-фосфат с образованием семиуглеродной кетозы седогептулозо-7-фосфата и альдозы глицеральдегид-3-фосфата. Эти два продукта далее вступают в следующую реакцию, называемую трансальдолазной. Трансальдолаза осуществляет перенос трехуглеродного фрагмента, «активного дигидроксиацетона» (атомы углерода 1 – 3), кетозы седогептулозо-7-фосфата на альдозу глицеральдегид-3-фосфат; в результате образуются кетоза фруктоза-6-фосфат и четырехуглеродная альдоза эритрозо-4-фосфат. Следующая реакция снова катализируется транскетолазой. В этой реакции ксилулозо-5-фосфат служит донором «активного гликоальдегида». Роль акцептора выполняет образовавшийся ранее эритрозо-4-фосфат. Продуктами этой реакции являются фруктоза-6-фосфат и глицеральдегид-3-фосфат.

Итак, избыток рибозо-5-фосфата, образованный в пентозофосфатном пути, может количественно превращаться в промежуточные продукты гликолиза.

Значение метаболического пути для различных тканей можно оценить по его активности. Пентозофосфатный путь активно протекает в печени, жировой ткани, коре надпочечников, щитовидной железе, эритроцитах, семенниках и в молочных железах в период лактации; он неактивен в нелактирующей молочной железе и малоактивен в скелетных мышцах. Все ткани, в которых активность данного пути высока, используют в реакциях восстановительного синтеза NADPH, например в реакциях синтеза жирных кислот, стероидов, аминокислот (с участием глутаматдегидрогеназы) или восстановленного глутатиона в эритроцитах. Вероятно, в условиях активного липогенеза или при наличии любой системы, утилизирующей NADPH, возрастает активная деградация глюкозы по пентозофосфатному пути в связи с увеличением отношения NADP

/NADPH. В условиях, которые возникают после приема пищи, может индуцироваться синтез глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы.

Регуляция скорости функционирования пентозофосфатного пути

Первая реакция окислительной ветви пентозофосфатного пути, дегидрирование глюкозо-6-фосфата, по существу необратима. Действительно, при физиологических условиях эта реакция лимитирует скорость процесса и выполняет функцию «контрольного пункта». Наиболее важным регуляторным фактором является концентрация NADP

, акцептора электронов при окислении глюкозо-6-фосфата в 6-фосфоглюконо-лактон. Кроме того, NADPH конкурирует с NADP

за связывание с ферментом, и АТР конкурирует с глюкозо-6-фосфатом. Отношение концентрации NADP

к концентрации NADPH в цитозоле печени крыс, содержащихся на полноценном рационе, составляет примерно 0,014, что на несколько порядков ниже отношения [NAD

] / [NADH], которое при этих же условиях равно 700. Выраженное действие концентрации NADP

на скорость превращений по окислительной ветви пентозофосфатного пути подтверждает, что генерирование NADPH тесно сопряжено с его использованием в восстановительных биосинтезах. Вопрос о регуляции неокислительной ветви пентозофосфатного пути до сих пор остается открытым.

Регуляция направления пентозофосфатного шунта

Судьба глюкозо-6-фосфата зависит от потребности в NADPH, рибозо-5-фосфате и АТФ.

В данном случае возможно четыре различные ситуации (схема регуляторных механизмов представлена на рисунке 5).

Рисунок 5: Схема регуляции направлений пентозофосфатного шунта

1. Потребность в рибозо-5-фосфате значительно превышает потребность в NADPH. Большая часть глюкозо-6-фос-фата превращается во фруктозо-6-фостфат и глицеральдегид-3-фосфат по гликолитическому пути. Затем две молекулы фрукто-зо-6-фосфата и одна молекула глицераль-дегид-3-фосфата превращаются под действием трансальдолазы и транскетолазы в три молекулы рибозо-5-фосфата путем обращения реакции, описанной ранее. Стехиометрия этого превращения следующая: