Сванте Пэабо.

Неандерталец. В поисках исчезнувших геномов



скачать книгу бесплатно

Я спрятал свой секретный рабочий дневник на самое дно ящика и вернулся к вирусам, которые мошенничали с иммунной системой с помощью хитрых маленьких белков, но все равно мумии не шли у меня из головы. Ведь другие видели нечто похожее на остатки клеток… И что это за коричневая субстанция? Может, это ДНК, но трансформированная в какую-то химическую форму, которая становится коричневой и светится синим в ультрафиолете… а может, ДНК сохраняется далеко не в каждой мумии… и вообще, наивно ожидать, что эта ДНК объявится с первого раза, нужно проверить много образцов, чтобы найти хотя бы один достойный. В этом случае оставалось единственное – убедить музейное руководство дать мне образцы от других мумий в надежде на исчезающе малый шанс найти древнюю ДНК. И я не представлял себе, как это сделать. Нужно было, по-видимому, найти способ быстро и наиболее щадящим образом анализировать мумии. И тут подсказку дало мое медицинское образование. Можно ведь использовать иглы, которыми берут образцы на биопсию из раковых опухолей, затем образцы фиксируют, окрашивают и исследуют под микроскопом. При этом образцы сохраняют замечательную детальность, опытный патолог может увидеть и нормальные клетки, к примеру, в эпителии кишечника, простате или молочных железах, и измененные раковые, различая их даже на ранних стадиях рака. И даже больше того, есть специальные красители, которые окрашивают ДНК прямо на предметных стеклах, и потом на них под микроскопом видно, есть ли в образце ДНК. Значит, я должен был взять мельчайшие пробы от множества мумий, окрасить их на предметных стеклах и исследовать под микроскопом. Больше всего мумий, естественно, в больших музеях. Но скорее всего, музейное руководство отнесется весьма скептически к просьбе некоего сверхвосторженного студента крошить их мумии ради какого-то утопического проекта.

И опять же Ростислав оказался на высоте. Он указал на один немецкий музей, где была богатая коллекция мумий и который в принципе благосклонно относился к сотрудничеству. Речь шла об Объединенном музейном фонде Берлина (Staatliche Museen zu Berlin), музейной ассоциации Восточного Берлина, столицы ГДР. Ростислав провел там довольно времени, разбираясь с коллекцией египетской керамики. Ему, профессору, разрешили работать в ГДР, вероятно из-за того, что он представлял Швецию, страну, которая пыталась найти “третий” путь развития, промежуточный между капитализмом и коммунизмом. Но скорее всего, первейшую роль сыграла его способность искренне дружить со всеми, без оглядки на любые границы – несколько руководителей музея стали его близкими друзьями. И вот летом 1981 года я сел в поезд, который привез меня к парому в Южной Швеции, а тот на следующее утро доставил меня в коммунистическую Восточную Германию.

В Берлине я пробыл две недели. Каждое утро я должен был проходить несколько пропускных пунктов и только после этого попадал в фондовые помещения музея Боде, расположенного на острове на реке Шпрее, почти в самом центре Берлина. На здании музея все еще оставались метины Второй мировой войны, хотя с тех пор прошло уже сорок лет.

На нескольких фасадах вокруг окон, куда целились советские автоматы в дни взятия Берлина, были явственно видны дырки от пуль. В первый день, когда меня повели смотреть довоенную коллекцию по Древнему Египту, мне была выдана специальная каска наподобие строительной. Причина скоро стала ясна. В крыше главного зала зияли дыры, оставленные дальнобойными снарядами и бомбами. Туда свободно залетали птицы, устраивая гнезда в саркофагах фараонов. Все, что состояло из более податливых материалов, чем камни, благоразумно унесли. На следующий день куратор египетской коллекции показал мне все свои мумии. Потом, в оставшиеся до обеда несколько часов, сидя в его пыльном неубранном кабинете, я брал образцы тех мумий, которые уже были развернуты и попорчены. Обед был долгим мероприятием, начиная с того, что на выходе мне снова нужно было пройти несколько проверок, а затем добраться через реку до ресторана. И там нас кормили жирной едой, которую приходилось заливать изрядным количеством пива и шнапса. Потом обратно в музей, и там возлияния опять продолжались под жалобы куратора, что он, мол, почти не бывал за границей, только один раз в Ленинграде. Скоро стало понятно, что мой хозяин мечтает поехать в какую-нибудь западную капиталистическую страну, и будь у него такой шанс, он бы там и остался. Я со всей возможной дипломатичностью дал ему понять, обрисовав потенциальные рабочие будни, что если бы он стал там, в западной стране, выпивать на работе, то немедленно был бы уволен: положение, неизвестное социализму. Но подобные печальные перспективы, кажется, не смогли очернить соблазнительные возможности капитализма, укоренившиеся в его воображении. Несмотря на все эти тянувшиеся часами теоретические дискуссии, я все же смог взять более тридцати образцов тканей мумий. Их я повез в Швецию.


Рис. 2.1. Хрящевая ткань египетской мумии из берлинского музея. В некоторых лакунах остатки клеток светятся (на фото – темные области) предположительно из-за присутствия сохранившейся ДНК. Фото: Сванте Пэабо, Университет Упсалы


Уже в Упсале я изготовил препараты для микроскопирования: вымочил образцы в солевом растворе, положил на предметные стекла и прокрасил, чтобы стали видны клетки в тканях. И стал смотреть. Я делал эту работу по выходным и вечерами, чтобы публика поменьше знала о моих занятиях. Но то, что можно было рассмотреть под микроскопом, расстроило меня. В мышечных тканях с трудом различались фибриллы, не говоря уже о каких бы то ни было следах клеточных ядер с ДНК. Я уже почти сдался. Но вот как-то вечером я рассматривал под микроскопом срез хряща из ушной раковины мумии. В плотной хрящевой ткани, как и в костной ткани, клетки помещаются в крохотных дырочках, или лакунах. Именно в этой плотной ткани хряща внутри лакун я увидел остатки клеток. В возбуждении я окрасил срез на ДНК. Руки мои тряслись, когда я устраивал стекло на предметном столике под микроскопом. Ого! Внутри хрящевых клеток видно было нечто, окрашенное правильным образом. В этих клетках действительно сохранилась ДНК!

С новыми силами я продолжил обработку берлинских образцов. Некоторые выглядели многообещающе. Особенно кусочек кожи с левой ноги детской мумии. Когда я окрасил этот образец на ДНК, то в клетках четко засветились ядра. Это и понятно, ДНК находится в ядрах клеток; вряд ли это светились бактериальные или грибные ДНК, потому что в таком случае они были бы распределены в образце неравномерно, там, где максимален их рост. Так что в моем образце сохранилась ДНК того самого ребенка, древнеегипетского. Я сделал миллион фотографий этого образца под микроскопом.

Среди моих образцов нашлось три со следами ДНК. В тканях того ребенка клетки сохранились лучше всего.

Тут меня стали мучить сомнения: вдруг эта мумия не из древних веков, а современная? Иногда появляются фальсификации – препараторы не прочь изготовить фальшивую мумию из трупа, чтобы заработать несколько долларов на туристах и коллекционерах. Какие-то из подделок могли быть впоследствии переданы музею. Музейные смотрители в Берлине не смогли найти для меня записей об этих конкретных мумиях, потому что каталоги были уничтожены во время войны. Так что датировки можно будет получить только с помощью радиоуглеродного анализа. К счастью, в Университете Упсалы я знал специалиста по углеродному датированию – Йорана Посснерта. Он работал на ускорительном масс-спектрометре, с помощью которого определяют соотношение изотопов в крошечных кусочках вещества и по этому соотношению оценивают возраст образца. Я спросил у него, сколько будет стоить один такой анализ, поскольку боялся, что мне просто не хватит на это моей мизерной аспирантской стипендии. Он меня пожалел, даже не стал называть цену – стоимость явно превышала мои возможности – и предложил провести анализ бесплатно. Я отнес образец Йорану и стал ждать. По мне, это самое в науке трудное – когда твоя работа зависит от других и совершенно невозможно повлиять на ход дела, остается только сидеть сложа руки и ждать результатов. Наконец я дождался новостей – и хороших. Возраст мумии был около 2400 лет, то есть относилась она примерно ко времени завоеваний Александра Македонского. Я выдохнул. Сначала я пошел и купил коробку шоколадных конфет для Йорана. Потом стал думать, как бы мне опубликовать результаты.

Когда я был в Германии, мне стали немного понятны чувства людей, живущих при социализме. Если я опубликую статью с простыми формальными благодарностями в их адрес, они ужасно огорчатся. А мне хотелось, чтобы все было сделано как следует. Поэтому, посоветовавшись с Ростиславом и со Штефаном Грюнертом, молодым и активным немецким египтологом, с которым подружился во время поездки в Берлин, я решил готовить эту первую статью по ДНК из мумий для восточногерманского научного журнала. С трудом вспоминая школьный немецкий, я описал свои открытия, включил фотографии мумии и гистологических образцов, окрашенных на ДНК. А между тем я сделал вытяжку ДНК из этого образца. И на сей раз смог показать, что ДНК действительно присутствовала в тестовом геле. И я включил картинку с гелем в свою статью. Большая часть ДНК разложилась, но все равно остались немногочисленные кусочки по несколько тысяч нуклеотидов; фрагменты примерно такой длины можно получить и из образцов свежей крови. А это означало, как я написал тогда, что по молекулам ДНК из древних тканей можно изучать отдельные гены – размер остатков это вполне допускает. Я рассуждал, какие широкие перспективы открылись бы при систематическом изучении ДНК египетских мумий. Статья заканчивалась обнадеживающей фразой: “Работы следующих нескольких лет покажут, насколько оправданы эти ожидания”. Я отослал рукопись Штефану в Берлин. Он поправил мой немецкий, и в 1984 году статья появилась в журнале Das Altertum, который подчинялся восточногерманской Академии наук[3]3
  S. P??bo. ?ber den Nachweis von DNA in alt?gyptischen Mumien. Das Altertum 30, 213–218 (1984).


[Закрыть]
. И никакого эффекта. Никто не написал мне, ни один человек не попросил оттиск… Меня-то результат воодушевил, но кроме меня, кажется, никого…


Пришлось параллельно написать еще одну статью в западный журнал – Journal of Archaeological Science, – потому что я понимал, что в восточногерманские журналы мало кто заглядывает. В этой статье я описал те же результаты, только полученные на базе анализа мумифицированной головы мужчины. Но теперь меня настигло отчаяние из-за невероятной медлительности издательства – отсрочки получились даже больше, чем в восточногерманском журнале, где пришлось править язык и тщательно согласовывать с политической цензурой. Наверное, столь изумительная неторопливость отражает ту медлительность поступи, с которой движутся все науки о древностях. Journal of Archaeological Science опубликовал мою статью в конце 1985 года[4]4
  S. P??bo. Preservation of DNA in ancient Egyptian mummies. Journal of Archaeological Sciences 12, 411–417 (1985).


[Закрыть]
– к тому моменту все ее результаты были сметены ураганом событий.


Итак, ДНК в мумиях есть, и следующий шаг очевиден – нужно клонировать ее в бактериях. Я обработал кусочки ДНК ферментами, которые увеличивают восприимчивость свободных концов нитей, смешал с бактериальными плазмидами, затем добавил ферменты, которые сшивают вместе концы ДНК. Если все сделано правильно, то получается гибридная молекула, в которой соединены ДНК мумии и бактериальной плазмиды. Когда такую плазмиду внедряют в бактерию, то вся плазмидная ДНК реплицируется, давая множество копий, в том числе и встроенных участков. Но более того, если в плазмиде присутствует ген устойчивости к антибиотику, то я могу, добавив в среду этот антибиотик, отобрать бактерий с успешно внедренными плазмидами. Если на среде с антибиотиком вырастут колонии бактерий, то это будет означать, что операция по добавлению чужеродного фрагмента к бактериальной последовательности прошла успешно. Каждая такая колония берет начало от бактериальной клетки, несущей кусочек ДНК из мумии. Результат нужно было проверить – и я проделал контрольные эксперименты, это наиважнейший элемент любой лабораторной работы. Я сделал все то же самое, но не добавил к плазмидам ДНК мумии, а в другом контрольном варианте добавил к плазмидам современную человеческую ДНК. Когда бактерии вобрали в себя раствор с плазмидами, я высадил их на агар (это обычная микробиологическая питательная среда) с антибиотиком и отправил на ночь в инкубатор с температурой 37 оС. Наутро я открыл дверцу инкубатора и в предвкушении вдохнул густой влажный запах питательной среды. На чашке с современной ДНК выросли тысячи колоний, они покрывали почти всю поверхность. Это значит, что плазмиды сработали – бактерии выжили, потому что захватили плазмиды внутрь клеток и стали их реплицировать. Чашка, где к плазмидам не было добавлено никаких ДНК, оказалась безжизненной – колоний на ней не было. Отсюда можно заключить, что в моем эксперименте не было никаких дополнительных источников ДНК. А в самой главной чашке, той, куда добавлены были ДНК берлинской мумии, выросло около сотни колоний. Я был совершенно счастлив – я со всей очевидностью реплицировал ДНК 2400–?летней мумии! Но только вдруг это ДНК бактерий из образца мумии, а не из самой мумии? Как доказать, что хотя бы часть этой ДНК принадлежит человеку?

Мне нужно было так или иначе определить последовательность этой ДНК, показав, что она человеческая, а не бактериальная. Если я возьму случайный клон, то может попасться и человеческий, и бактериальный фрагмент, а я потрачу на определение его последовательности, секвенирование, огромный труд; ведь тогда, в 1984 году, человеческий геном за исключением небольших участков еще не расшифровали, не говоря уже о сотнях геномов микроорганизмов. Поэтому меня не воодушевляла идея секвенировать случайный клон, нужно было выбрать строго определенный. Тут очень пригодилась методика, позволяющая идентифицировать клон, в котором присутствует последовательность нуклеотидов, похожая на некую заранее известную. Нужно взять некоторое количество бактерий из каждой колонии, поместить их на особый бумажный фильтр, где бактерии будут разрушены и их ДНК свяжется с веществом фильтра. Затем можно взять раствор с кусочками одноцепочечных ДНК, в которых присутствуют радиоактивные изотопы; эти “пробные” цепочки представляют ту последовательность, которую нужно выявить. Они будут гибридизоваться с комплементарными цепочками ДНК, присутствующими на фильтре. Я выбрал участок ДНК с характерным элементом человеческого генома – повтором Alu. Эта последовательность примерно из трехсот нуклеотидов встречается в геноме человека почти миллион раз, еще она имеется у обезьян. Этот повтор настолько распространен в человеческом геноме, что составляет более 10 процентов от его объема. Если бы такой повтор нашелся в бактериальных клонах, то это бы означало, что хотя бы в некоторых из них содержится ДНК человеческой природы.

Я взял кусочек гена, с которым занимался в лаборатории – там, как я знал, имелся повтор Alu, – внедрил в него радиоактивную метку. А потом обработал фильтр с теми самыми клонами. Некоторые из них гибридизовались с радиоактивной цепочкой – что и следовало ожидать от ДНК с человеческими свойствами. Я выбрал клон с самыми явными признаками гибридизации. Он содержал фрагмент ДНК, состоящий из примерно 3400 нуклеотидов. Взяв в помощники Дана Лархаммара, дипломника, который слыл у нас специалистом по секвенированию ДНК, я определил часть последовательности ДНК клона. И там действительно нашелся элемент Alu. Я очень обрадовался. В моих клонах присутствовала человеческая ДНК, она была получена именно с помощью бактериального клонирования.

Пока я возился с гелем и секвенированием в ноябре 1984 года, в журнале Nature появилась статья, имевшая ко мне самое непосредственное отношение. Расселу Хигучи, работавшему в лаборатории Алана Уилсона, автора гипотезы “из Африки” и одного из самых сильных эволюционных биологов своего времени, удалось выделить и клонировать ДНК из столетней шкуры квагги, родственника зебры, обитавшего еще сто лет назад в Южной Африке. Рассел Хигучи выделил два фрагмента митохондриальной ДНК и показал, что, как и ожидалось, квагга ближе к зебрам, чем к лошадям. Эта работа вдохновила меня несказанно. Если уж Алан Уилсон взялся за древнюю ДНК и если Nature счел исследование 120–?летней ДНК стоящим, то уж мои занятия не были ни дикими, ни тривиальными.

Впервые я сел за статью, которая, как мне виделось, должна заинтересовать многих. Подбодренный примером Алана Уилсона, я решил готовить ее для Nature. Я описал, как я работал с мумией из Берлина. И я, конечно же, сослался на ту статью, которая появилась в восточногерманском журнале. Но перед тем как отослать рукопись в Лондон, в издательство Nature, мне нужно было кое-что сделать. Я обязан был поговорить с моим руководителем, Пером Петтерссоном, показать ему рукопись, которую подготовил для публикации. К нему в кабинет я вошел с некоторым трепетом. Рассказал о том, чем занимался все это время, и о своих достижениях. Также предложил присоединиться к статье и быть соавтором, ведь он мой руководитель. Как же я недооценивал этого человека! Вместо того чтобы пенять мне на внеплановую трату фондов и драгоценного рабочего времени, он восхитился. Он обещал прочитать рукопись и сказал, что, естественно, не собирается быть соавтором работы, о которой только что узнал.

Несколькими неделями позже я получил из редакции Nature сообщение: они обещали опубликовать статью, если я отвечу на несколько небольших замечаний рецензентов. И вскоре я получил корректуру. Тут я стал подумывать, как бы мне подступиться к Алану Уилсону – в моем представлении полубогу – и после защиты диссертации напроситься к нему в лабораторию в Беркли. Не найдя ничего лучшего, я отправил ему корректуру без всяких комментариев, решив, что такому человеку будет приятно увидеть статью первым, до того как другие смогут прочесть ее в Nature. А потом напишу и спрошу насчет возможности поработать под его началом. В Nature с удивительной расторопностью управились с рукописью и даже нарисовали иллюстрацию на обложку к этому выпуску – мумия, обернутая спиралью ДНК. Но еще быстрее я получил ответ от Алана Уилсона, адресованный “профессору Пэабо”, – тогда, в доинтернетный и догугловый век, узнать наверняка, кто я такой, было очень трудно. Само письмо тоже было примечательно. Он спрашивал, не мог бы он провести свой грядущий преподавательский отпуск[5]5
  В западной научной системе преподаватель университета может взять длительный отпуск, так называемый sabbatical, чтобы заняться собственными исследованиями. (Прим. перев.)


[Закрыть]
в МОЕЙ лаборатории! Такая вот забавная оплошность, случившаяся только из-за того, что я не знал, как написать письмо. Мы с товарищами в лаборатории шутили, что нельзя упустить возможность заставить Алана Уилсона, великого эволюционного биолога, мыть для меня пробирки целый год. Я сел отвечать ему – что я не профессор и даже еще не защитил диссертацию и что лаборатории у меня никакой нет, поэтому приезжать в свой отпуск ему некуда. Зато я поинтересовался, нельзя ли мне после аспирантуры приехать к нему в Беркли поработать.

Глава 3
Умножить прошлое

Алан Уилсон ответил мне изысканным письмом, пригласив поработать в его группе после защиты диссертации. И я оказался на перепутье. После защиты передо мной открывались три возможности. Первая – завершать свое медицинское образование в больнице (что заранее навевало на меня скуку после горячки недавних открытий). Вторая: поступить в какую-нибудь крупную лабораторию и в продолжение диссертации приняться за многообещающую и вполне успешную работу над вирусами и иммунной защитой. Или – на столе лежало предложение от Алана – заняться выделением древних генов. Коллеги и профессора, с которыми я обсуждал свой выбор, наперебой советовали второй вариант. Их аргументы были вполне очевидными: интерес к древним ДНК не более чем курьезное хобби, оно отвлекает меня от серьезных исследований, за которыми будущее и науки, и мое. Третий вариант, конечно, казался мне самым соблазнительным, но меня одолевали сомнения: может, все-таки заняться реальной наукой, вирусологией, а не играми в “молекулярную археологию”, которая пусть и впрямь остается моим хобби? Решение пришло в 1986 году, на симпозиуме в Колд-Спринг-Харбор.

Лаборатория Колд-Спринг на Лонг-Айленде в Нью-Йорке – это мекка для молекулярных биологов. Там организуются многочисленные встречи и конференции, и не последним среди них является ежегодный симпозиум по численным методам в биологии. После публикации моей статьи в Nature[6]6
  S. P??bo. Molecular cloning of ancient Egyptian mummy DNA. Nature 314, 644–645 (1985).


[Закрыть]
 меня пригласили на этот симпозиум, там я впервые сделал доклад по своей работе о ДНК мумий. Одно это было бы для меня из ряда вон выходящим событием, но нет, мало того, на симпозиуме присутствовали люди, которых я знал только по их публикациям, и сам Алан Уилсон, и Кэри Муллис, который на той же сессии, что и я, представил и описал полимеразную цепную реакцию. ПЦР оказалась настоящим методологическим прорывом, сразу отправившим на склад истории громоздкую методику клонирования ДНК в бактериях. Мне сразу стало совершенно очевидно, что для изучения древних ДНК я прекрасно смогу воспользоваться новыми методами. По сути, ПЦР позволяла выделять и размножать необходимые сегменты ДНК, даже если их сохранилось совсем немного. Сам Кэри в конце своего доклада, отсылая слушателей к моей работе, отметил, что ПЦР – идеальный инструмент для изучения мумий. Я дождаться не мог, когда же можно будет это попробовать!



скачать книгу бесплатно

страницы: 1 2 3 4 5 6 7 8