Коллектив авторов.

Муковисцидоз: определение, диагностические критерии, терапия. Национальный консенсус



скачать книгу бесплатно

3.8. Этнические особенности спектра мутаций в гене CFTR у российских больных МВ

Спектр и относительные частоты мутаций гена CFTR могут существенно варьироваться не только в разных обследуемых регионах, но и в разных этнических группах. В регионах с преобладающим русским населением наиболее частыми являются мутации F508del (50-55%), CFTRdele2,3 (3,5-8,3%), 2143delT (1,1-3,8%), 2184insA (1,5-2,5%). Наименьшее значение относительной частоты мутации F508del отмечено в Северо-Кавказском ФО – 28,57%, но здесь высокую долю составляют мутации 1677delTA (18,75%), W1282X (16,07%) и E92K (2,68%). Мутация 1677delTA распространена среди автохтонных народов Кавказского региона. Так, у чеченских пациентов с МВ (34 индивида) ее доля составляет 66,2%, высока также доля мутации E92K (14,7%).

В недавно проведенной работе, в рамках которой исследованы больные МВ из Республики Чувашия [35], показано, что превалирующей по частоте мутацией у чувашских пациентов является мутация E92K, ранее обнаруживаемая в странах юго-восточного Средиземноморья, в частности в Турции [26, 36]. Мутация E92K обнаружена на 55,6% мутантных хромосом (20/36) у 18 обследованных чувашских пациентов, тогда как относительная доля мутации F508del составила 25% (9/36). Анализ здоровых индивидов показал, что гетерозиготным носителем мутации E92K является каждый 68-й житель Чувашии (5/343, т.е. 1:68), а мутации F508del – каждый 86-й [35]. Мутация E92K встречается у пациентов из разных популяций Волго-Уральского региона (Чувашия – 53,19%, Удмуртия – 6,76%, Татарстан – 2,38%, Башкирия – 1,37%, Самарская область – 3,06%, Пермский край – 0,75%, Оренбургская область – 1,96%), в Ханты-Мансийском АО (3,85%), а также во многих других регионах РФ [34]. Высокая доля мутации E92K у чувашей, вероятно, объясняется эффектом основателя и прохождением популяции чувашей через «бутылочное горлышко» в XIV веке.

Мутация W1282X встречается в разных регионах мира. Предполагают, что мутация W1282X произошла в результате единичного мутационного события в популяции ближневосточных евреев до их переселения в Европу. Наибольшей величины ее частота достигает в популяции евреев-ашкенази Израиля (до 50% мутантных аллелей у больных с МВ). Распространение мутации W1282X в других регионах Европы и мира связывают с расселением евреев-ашкенази. Относительно высокая доля этой мутации наблюдается в регионах с высоким уровнем урбанистического населения. Аналогичную тенденцию можно наблюдать и в России: в Москве – 2,93%, Смоленске – 2,94%, Новосибирске – 2,56%, Кемеровской области – 2,17% [34]. Интересным фактом является недавно обнаруженная высокая доля мутации W1282X у больных МВ карачаевцев (18 из 20 аллелей, 90%). Частота мутации W1282X в выборке здоровых карачаевцев из Карачаево-Черкесии составила 1,8% (6/660 хромосом). Проникновение мутации W1282X на Восточный Кавказ можно связать с миграцией евреев из Византии через северное Причерноморье или Грузию в раннем средневековье, или через Персию, или Иран в позднем средневековье.

Высокую долю мутации W1282X в этой популяции можно объяснить эффектом основателя [37]. Кроме «урбанистической» привязанности также очевиден вектор распространения мутации W1282X с юга на север – с максимальной концентрацией в кавказских республиках (в частности, в Карачаево-Черкесии) и минимальной встречаемостью в регионах севернее Москвы.

Мутацию 394delTT называют «нордической» («северной»): она распространена с высокой частотой в странах, расположенных по побережью Балтийского моря и вдоль связанных с ним речных путей (в Швеции, Норвегии, Дании, Финляндии, Эстонии, России и т.д.). В России эта мутация обнаружена также в регионах проживания тюркоязычных народов, в этногенезе которых прослеживается угро-финский элемент (Татарстан – 1,59%, Башкирия – 1,37%, Нижегородская обл. – 1,41%, Оренбургская обл. – 1,96%, Самарская обл. – 1,02%) [34].

Мутация 1677delTA, впервые обнаруженная у грузинских пациентов [26, 38], распространена на Кавказе у людей, относящихся и к другим этническим группам: у чеченцев, ингушей, армян и др. (см. Табл. 2).

В небольшой группе пациентов из Дагестана неоднократно выявлены мутации: A96E, S1159F, R1066C, 1248+1G>A (последняя мутация также однократно встретилась у осетина).


Таблица 2. Спектр мутаций в гене CFTR в этнических группах российских больных муковисцидозом


1 – [34]; 2 – [35]


В НИИ медицинской генетики, Томский НИМЦ (г. Томск), систематически проводится анализ спектра мутаций гена CFTR у больных МВ из Сибирского региона (среди обследованных пациентов преобладают русские). Помимо основного, наиболее частого, генного дефекта F508del, следующие мутации выявляются с частотой >4%: CFTRdele2,3, E92K, 2184insA, R1066C; с частотой >2%: G542X, 3849+10kbC>T, R1162X, 2143delT, L138ins, E217G и функционально значимый вариант 5T (IVS8-5T); с частотой ~1%: 2184delA, 394delTT, W1282X, N1303K, R347P, R553X, 3821delT, R117C, Y569C, 3791delC, 2789+5G>A, L1335P, 4015delA, 4040delA, W1310X, R1158X, 1898+1G>C, 1898+1G>A, 1898+2T>C, S1196X, G228R, Q98R, 3944delGT, I148T, 4382delA и крупные внутригенные делеции/ дупликации. Охарактеризованы мутации у представителей коренных народностей Сибири (буряты, хакасы, тувинцы, алтайцы). Спектр определенных у них мутаций: F508del, c.650A>G (E217G), R1066C, R1162X, c.293A>G (Q98R), c.682G>C (G228R); две последние – новые мутации [39].

3.9. Подход к генетическому тестированию

По рекомендациям Европейского консенсуса по МВ [2], для обеспечения высокой эффективности диагностический метод должен обеспечивать выявление по крайней мере одной клинически значимой мутации в гене CFTR не менее чем у 90% больных МВ. При ДНК-диагностике необходимо обеспечивать качественное и достоверное обнаружение генетических вариантов в исследуемой популяции/регионе. Использование в ходе тестирования ограниченного набора мутаций может привести к возникновению ряда проблем, связанных с невысокой диагностической чувствительностью такого подхода в генетически гетерогенных популяциях, и необходимости разработки специфических диагностических панелей, включающих расширенный спектр мутаций.

Для обеспечения достоверности результатов проводимых исследований следует разработать алгоритм и стандарты проведения молекулярно-генетического тестирования и использовать лишь те диагностические методы и наборы реагентов, которые прошли необходимые клинические испытания и имеют подтвержденные в рамках тестирования на достоверной выборке образцов из российской популяции диагностические и аналитические характеристики.

Также необходимо отметить важность создания и ведения регистра пациентов с МВ с обязательным внесением в него информации об определенном генотипе в целях разработки более оптимальных диагностических панелей для конкретных регионов.

3.9.1. Панели мутаций гена CFTR, используемые в Российской Федерации

1. CFTRdele2,3, G85E, 394delTT, R117H, E92K, A96E, L138ins, 604insA, 621+1G>T, R334W, R347P, S466X (TGA), I507del, F508del, 1677delTA, 1717-1G>A,G542X, G551D, R553X, 2143delT, 2183AA>G, 2184insA, 2789+5G>A, 3272-16T>A, S1159P(F), S1196X, 3667insTCAA, 3821delT, 3849+10kbC>T, W1282X, W1282R, 3944delGT, N1303K – лаборатория генетической эпидемиологии ФГБНУ «МГНЦ» (www.med-gen.ru) [35, 36, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 46].

2. F508del, I507del, 1677delTA, CFTRdele2,3, E92K, 3849+10kbC>T, R334W, R347P, G551D, R553X, G542X, 2143delT, 2184insA, 394delTT, 306delTAGA, 3821delT, L138ins, N1303K, W1282X, 3944delGT, 2176insC, 2183delAA, 2183AA>G и коммерческий набор «Elucigene CFEU2v1» (фирма Gen-Probe, США) на 50 частых европейских мутаций – НИИ медицинской генетики, Томский НИМЦ (www. medgenetics.ru) [39].

3. CFTRdele2,3, G85E, 394delTT, R117H, E92K, E92X, L138ins, 621+1G>T, R334W, R347P, S466X, I507del, F508del, 1677delTA, 1898+1G>C, G542X, G551D, R553X, L581X, 2143delT, 2183delAA, 2183AA>G, 2184insA, S945L, R1066C, S1159P, R1162L, L1335P, R1162X, S1196X, 3849+10kbC>T, W1282X, W1282R, N1303K – НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН, СПб. [48].

4. CFTRdele2,3, F508del, I507del, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT, 3821delT, G542X, W1282X, N1303K, L138ins, R334W, 3849+10kbC>T, 604insA, 3944delGT, S1196X, 621+1G>T, E92K, 327226A>G, 4015delA, 4022insT, W1282R, 2785+5G>A, 3272-16T>A, S466X, 1898+1G>A, 3120+1G>A, R347P, S945L – компания «Центр молекулярной генетики» (http://www.dnalab.ru/ diseasesdiagnostics/cysticfibrosis).

5. F508del, CFTRdele2,3, E92K, 3849+10kbC>T, 2184insA, W1282X, 2143delT, N1303K, G542X, 1677delTA, L138ins, R334W, 394delTT, 3821delT, 2789+5G>A, S466X, S1196X, 3272-16T>A, W1282R, 3944delGT, 3849G>A, 712-1G>T, 621+1G>T, R553X, 367del5, 4015delA, G85E, W1310X, S1159P, R347P, CFTRdup 6b-10, S945L, R1066C, 1898+1G>A, R1162X, S1159F, L1335P, R785X, R117H, 4428insGA, D1152H, 604insA, 624delT,I506T, A96E,3859delC,1716+1G>A, 3272-26A>G, G551D, 2183AA>G – лаборатория молекулярной генетики и клеточной биологии ФГАУ «НЦЗД» Минздрава России, г. Москва.

Качество и достоверность результатов молекулярно-генетического тестирования в значительной степени зависят от комплекса факторов:

• наличия стандартов и контрольных образцов для проверки качества исследования в лаборатории;

• спектра тестируемых генетических нарушений гена CFTR;

• метода, используемого для проведения исследования;

• диагностических характеристик используемой панели мутаций в гене CFTR для популяции, в которой проводится исследование;

• квалификации специалиста, выполняющего лабораторную часть исследования;

• квалификации специалиста, выполняющего интерпретацию и трансляцию результатов тестирования;

• наличия внешнего контроля качества исследования;

• использования стандартного и однозначного алгоритма ДНК-тестирования в общей схеме диагностики МВ.

3.9.2. Стратегия молекулярной диагностики МВ

Согласно выработанным Консенсусом по МВ рекомендациям [2], стратегия молекулярной диагностики МВ включает несколько этапов.

На первом этапе проводится поиск мутаций, наиболее частых в популяции, к которой принадлежит обследуемый. Для многих стран Европы и Америки определены специфичные панели, обычно включающие 25-35 мутаций, позволяющие выявить до 75-90% всех мутантных аллелей гена CFTR. Применяемые в России панели представлены в Разделе «Панели мутаций гена CFTR, используемые в Российской Федерации».

На втором этапе проводят расширенный поиск более редких мутаций, используя секвенирование по Сэнгеру или высокопроизводительное секвенирование генома (MPS/NGS).

В ФГБНУ «МГНЦ» (Москва), НИИ медицинской генетики, НИМЦ (Томск), НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН (Санкт-Петербург) и в ООО «Центр молекулярной генетики» (Москва) на втором этапе используют метод секвенирования по Сэнгеру для выявления мутаций в гене CFTR у пациентов, у которых на первом этапе не были идентифицированы одна, либо обе мутации. Компанией «Парсек Лаб» (Санкт-Петербург) (www.parseq.pro) разработан метод диагностики мутаций гена CFTR на основе высокопроизводительного секвенирования нового поколения. В автоматическом режиме выявляются 319 мутаций, ответственных за развитие клинически значимых проявлений МВ, а также широкий спектр мутаций с неподтвержденным/неизвестным клиническим эффектом (включая мутации de novo). Метод позволяет также обнаруживать крупные делеции/ дупликации гена. Все выявленные методом NGS патогенные варианты гена CFTR подтверждаются методом секвенирования по Сэнгеру [47].

В лаборатории молекулярной генетики и клеточной биологии ФГАУ «НЦЗД» Минздрава России проводится диагностика методом NGS с использованием технологии таргетного обогащения всех кодирующих, прилегающих интронных, а также 3?– и 5?-нетранслируемых областей гена CFTR. Все выявленные на этом этапе патогенные варианты гена CFTR также подтверждаются методом секвенирования по Сэнгеру.

Третий этап. Обычными сканирующими методами, в том числе секвенированием, можно выявить нарушения последовательности гена, незначительные по протяженности: нуклеотидные замены, небольшие делеции/инсерции. Перестройки, охватывающие несколько экзонов/интронов, такими методами не выявляются. Это можно сделать, используя следующие технологии: MLPA – мультиплексную лигазную зондовую амплификацию либо QFMP – количественную флуоресцентную мультиплексную ПЦР.

К настоящему времени у российских пациентов с МВ выявлены несколько протяженных делеций: CFTRdeleprom.-10, CFTRdele2-8, CFTRdele5-6a, CFTRdele5-10, CFTRdele12-13,16, у нескольких пациентов выявлены делеция CFTRdele6b-10, а также протяженные дупликации: CFTRdup6b-10, CFTRdup23,24, CFTRdupprom-10. Следует учитывать, что, согласно данным Европейского консенсуса по МВ, проведение расширенного молекулярного исследования гена CFTR позволяет выявить мутацию в 98%. Результаты поиска мутаций в гене CFTR у российских пациентов, проведенного в соответствии с представленной стратегией, согласуются с данными Европейского консенсуса [41]. И все-таки остается небольшое число пациентов, у которых одна или даже обе мутации не идентифицированы. Это может быть связано либо с тем, что использованные методы не позволили проанализировать регионы гена, где располагаются мутации, либо с явлением однородительской дисомии, либо с фенокопиями МВ. В таких случаях при проведении сегрегационного анализа сцепленных с геном CFTR ДНК-маркеров можно определить статус носительства определенных гаплотипов членами обследуемой семьи и подтвердить или опровергнуть обусловленность заболевания нарушениями в гене CFTR. Так, выявлены две семьи из Германии, в которых дети с МВ унаследовали от родителей оба гена CFTR, так же как и их здоровые сибсы; а также две семьи из США, где больные сибсы различались по обеим родительским копиям гена CFTR [2].

3.10. Пренатальная диагностика МВ. Организация пренатальной диагностики МВ в России

Особого внимания заслуживает пренатальная диагностика (ПД) МВ в семьях высокого риска. Отличительной чертой молекулярной диагностики является ее универсальность. Это означает, что диагностика может проводиться на любой стадии онтогенеза, в том числе до рождения, и материалом для ДНК-анализа могут быть любые клетки и ткани плода.

Благодаря успехам медицины зародыш человека доступен для исследований, а значит, и для диагностики практически на любой стадии развития. Выбор инвазивного метода определяется сроком беременности, инструментальной и методической оснащенностью центра ПД, а также квалификацией акушера-оператора. Для забора плодного материала обычно используют один из трех основных методов. К таковым относятся трансабдоминальная аспирация ворсин хориона/плаценты, амниоцентез или кордоцентез. Образцы ДНК выделяют из биоптатов хориона (плаценты), клеток амниотической жидкости или лимфоцитов пуповинной крови плода. При необходимости для молекулярного анализа можно использовать соскоб клеток с цитологических препаратов, ранее использованных для кариотипирования зародыша. Принимая во внимание высокую точность методов молекулярной диагностики, их большую чувствительность, необходимо помнить, что ее эффективность в значительной мере предопределена соблюдением следующих основных правил:

1. Необходимость точного клинического диагноза у пробанда

Отсутствие точного клинического диагноза «МВ» у пробанда делает применение молекулярно-генетических методов при ПД некорректным (учитывая, что при невыявленных патологических мутациях у пробанда предполагается проводить косвенную пренатальную ДНК-диагностику по сцепленным ДНК-маркерам). К сожалению, несовершенство лабораторных методов, недостаточный опыт клиницистов и медицинских генетиков, консультирующих семьи высокого риска, нередко ведут к тому, что на инвазивную ПД направляются женщины, не относящиеся к группе высокого риска по этому заболеванию.

2. Своевременное обследование молекулярными методами больного и семьи высокого риска

Идентификация мутаций в гене CFTR в каждой семье – необходимое условие успешной ПД. Особенно важно, чтобы идентификация мутаций и молекулярное маркирование мутантных хромосом были проведены еще при жизни больного и ДНК-обследование каждой семьи высокого риска осуществлено до наступления следующей беременности. Своевременное направление семей или образцов крови семей высокого риска до наступления следующей беременности в центры ДНК-диагностики для идентификации мутаций и выяснения информативности семьи является одним из необходимых условий успешного проведения ПД.

3. Выбор оптимального срока ПД

Решающим преимуществом молекулярной диагностики является возможность использовать для анализа любые ДНК-содержащие клетки организма или ткани. Анализ может быть проведен на любой стадии онтогенеза, начиная со стадии зиготы. На сегодняшний день можно диагностировать МВ в доимплантационном периоде. Материалом для диагностики являются полярные тельца зиготы или отдельные бластомеры дробящейся яйцеклетки, полученные микрохирургическим путем от доимплантационных зародышей – продуктов экстракорпорального оплодотворения.

Исходя из интересов женщины, оптимальным периодом для ПД молекулярными методами считается I триместр (10-12-я неделя). Это, однако, требует детального ДНК-анализа семьи еще до наступления беременности. Нередко ДНК-диагностику проводят и во II триместре, особенно в частично информативных семьях, когда необходимо дополнить ДНК-диагностику соответствующими биохимическими исследованиями.

4. Получение не загрязненного материнскими тканями материала плода

В ПД молекулярными методами важно предотвратить контаминацию плодного образца материнскими клетками. Учитывая крайне высокую чувствительность метода ПЦР, избежать загрязнения образцов плодных тканей материнскими клетками можно только путем тщательного отбора ворсинок хориона или плаценты под бинокулярной лупой с последующим отмыванием физиологическим раствором. Особенно важно не допустить попадания материнской крови при заборе пуповинной крови плода путем кордоцентеза. Высокий уровень акушера-оператора и использование качественных реакций на выявление примеси материнской крови позволяют избежать этого осложнения [49].

5. Четкость рекомендаций после ПД

Исходом пренатальной ДНК-диагностики может быть подтверждение диагноза «МВ» у плода или его исключение (с максимальной вероятностью 99,9%). В последнем случае плод может быть гетерозиготным носителем или не иметь мутантного аллеля гена CFTR.

В любом случае женщина (семья) должна быть в максимально сжатые сроки осведомлена о результатах диагностики и, соответственно, о вероятности рождения больного гетерозиготного носителя или полностью здорового ребенка.

Окончательное решение о сохранении или прерывании беременности всегда остается прерогативой самой пациентки. При прерывании беременности настоятельно рекомендуется верификация диагноза молекулярными или другими доступными методами.

Нередко ПД молекулярными методами оказывается затруднена в семьях высокого риска, в которых больной МВ ребенок уже умер, а мутации гена CFTR не удалось идентифицировать. В таких семьях возможна ПД заболевания биохимическим методом.

Характерные изменения в спектре белков амниотической жидкости плодов с МВ выявляются в течение короткого периода (с 16-й по 20-ю неделю беременности) и являются результатом нарушения проходимости кишечника плода вследствие транзиторного или персистирующего илеуса.

Пренатальная диагностика муковисцидоза в России проводится в ФГБНУ «МГНЦ» (Москва), НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН (Санкт-Петербург) и в ООО «Центр молекулярной генетики» (Москва).

Алгоритм и точность молекулярной ПД, возможные источники ошибок

В ПД молекулярными методами важно учитывать два основных источника ошибок: 1) контаминацию плодного образца материнскими клетками (о которой сказано выше) и 2) возможность кроссинговера при использовании непрямого (косвенного) метода диагностики.

Опыт ПД МВ в России доказывает целесообразность применения как молекулярных, так и биохимических методов ПД.

Разработан оптимальный алгоритм ПД МВ в семьях высокого риска. Согласно данному алгоритму, в каждой семье проводятся молекулярные исследования для определения информативности, т.е. пригодности семьи для молекулярной диагностики.

На 1-м этапе отрабатываются варианты наиболее простой и надежной прямой молекулярной диагностики (идентификация мутаций). Достоверность молекулярной диагностики МВ прямым методом, т.е. путем идентификации мутаций в самом гене CFTR, очень высока и приближается к абсолютной. Несмотря на такую точность, учитывая все многообразие возможных изменений в геноме при созревании гамет (кроссинговер) и на начальных стадиях эмбриогенеза (мутагенный эффект), более оправданной является точность ответа около 99,9%.

На 2-м этапе (при наличии больного ребенка и отсутствии идентифицируемых мутаций) тестируются варианты косвенной диагностики (анализ внутригенных ДНК-маркеров: IVS1CA, IVS6aGATT, IVS8CA, IVS17bCA, IVS17bTA и сцепленных с геном CFTR ДНК-маркеров: XV-2c, KM19, CS7, J3.11, W30). Следует учитывать, что при использовании внегенных полиморфных сайтов вероятность ошибки диагностики будет прямо пропорциональна их расстоянию (и, соответственно, частоте кроссинговера) от гена CFTR. Точность непрямой диагностики достаточно высока, т.к. величина внутригенного кроссинговера, как правило, не превышает 0,1%, а частота кроссинговера между локусом гена CFTR и локусами используемых внегенных ДНК-маркеров – менее 1%. Принципиально важно проанализировать в семье высокого риска достаточное количество полиморфных сайтов для точного определения, с каким конкретным аллелем наследуется мутантный ген. Оптимальным является подбор двух-трех информативных для семьи ДНК-маркеров. При использовании вне-генных маркеров предпочтительно анализировать маркеры, фланкирующие локус гена. Точность ответа при косвенной диагностике варьируется от 99 до 99,9% в зависимости от использованного ДНК-маркера.



скачать книгу бесплатно

страницы: 1 2 3 4 5 6 7